SORL1基因表达及其rs2282649位点多态性与迟发性阿尔茨海默病相关性研究*

王健杨军平

SORL1基因表达及其rs2282649位点多态性与迟发性阿尔茨海默病相关性研究*

王健①杨军平①

目的：分析江西地区汉族人群分拣蛋白相关受体1（SORLl）及其rs2282649位点多态性与迟发性阿尔茨海默病（LOAD）是否存在关联。方法：采用病例对照研究，提取所有研究对象的外周血中基因组DNA，应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增DNA，送至深圳华大基因应用单碱基多位点微测序法（snaPshot）检测SORLI基因和rs2282649位点单核苷酸多态性的表达分布情况。结果：LOAD组和对照组的基因型频率、等位基因的分布具有群体代表性（P>0.05）。LOAD组中TT、TC和CC基因型分别为80例（59.3%）、35例（25.9%）和20例（14.8%），对照组分别为64例（34.2%）、75例（40.1%）和48例（25.7%），两组的SORLl基因rs2282649单核苷酸多态性基因型分布比较差异有统计学意义（ 字2=11.254，P=0.007），两组的C等位基因频率分布比较差异有统计学意义（ 字2=5.402，P=0.019，OR=1.528，95%CI=0.872～2.116）。结论：SORL1基因与江西地区汉族人群LOAD的发生相关，其中rs2282649位点单核苷酸多态性占据重要作用，C等位基因为危险等位基因。

阿尔茨海默病；SORLl基因；单核苷酸多态性

阿尔茨海默病是老年痴呆最重要的病因，给患者及社会都带来沉重的负担，其中又以迟发性阿尔茨海默病更为多见[1]。分子遗传学研究表明遗传异质性是AD的发生的重要危险因素。继Strittmatter等[2]于1993年首次发现APOE基因84等位基因是LOAD（Late-onset type of alzheimer's disease）的主要风险因素之后，SORLl（Sortilin-related Receptor 1）成为第二个AD发生的独立风险因素，并成为AD的研究热点[3]。目前研究主要关于北欧人，西班牙人，非洲的美国人和以色列的阿拉伯人，关于亚洲或者我国人群的研究甚少。高欣等[4]研究发现SORLI基因rs2070045位点单核苷酸多态性与北京地区汉族人群遗忘型轻度认知功能障碍（aMCI，Amnestic Mild Cognitive Impairment）的发生明显相关，G等位基因为危险等位基因。但是SORLl基因rs2282649位点多态性在中国汉族AD人群中尚无报道，本研究通过对LOAD患者SORLl基因rs2282649位点进行基因多态性检测，探讨该位点多态性与LOAD的相关性和风险。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月-2015年6月在江西地区经筛查得到LOAD患者135例作为LOAD组，男58例，女77例，平均年龄（76.2±5.3）岁；体检正常者187例作为对照组，男84例，女103例，平均年龄（72.7±6.9）岁。对照组与LOAD组性别、文化程度、生活背景等相互匹配，并确定为无血缘关系的健康者，两组的一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 纳入与排除标准 （1）纳入标准：LOAD组入选患者均符合美国AD和相关疾病协会（NINCDS-ADRDA）临床诊断标准确定为“可能AD”的标准；美国精神病学会诊断和统计手册痴呆诊断标准第四版（DSM-Ⅳ-R）轻、中度痴呆标准。简易精神状态检查表（MMSE，Mini-mentalstate Examination） 评 分 9～23分， 平 均（15.1±1.98）分；临床痴呆评定量表（CDR，Clinical Dementia Rating）评分为l（轻度）47例或2（中度）88例；Hachinski缺血指数（HIS，Hachinski Ischaemic Scale）<4分排除血管性痴呆；由参与研究的主治医师综合患者病史、体征、检查资料和量表评分作出诊断。对照组均符合无记忆减退主诉，无严重躯体器质性疾病，配合研究；MMSE总分≥26分；CDR=0。（2）排除标准：血管性痴呆、帕金森氏性痴呆及脑器质性疾病所致的各种老年痴呆患者；正处于心血管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者；头部外伤史、特殊药物服用史等；拒绝签署受检者知情同意书者。

1.3 方法

1.3.1 基本资料采集 研究对象行血、尿常规、血糖、血脂、肾功能检查，必要时行脑卒中超声筛查、心脏超声检查，所有患者行头颅CT平扫。

1.3.2 基因组DNA提取 清晨取空腹静脉血5 mL，血样加EDTA抗凝剂后保存于-80 ℃冰箱中，用于DNA提取。受过专业培训的研究人员采用“酚-氯仿法”进行基因组提取[5-6]。将血凝块样本解冻后，搅碎至无明显大块血凝块，加生理盐水至10 mL，充分混匀，3000 rpm离心10 min，弃掉上清。沉淀中加入2 mL CTAB，捣碎沉淀，血凝块碎片小于上一步骤，加水至10 mL，充分混匀，3000 rpm离心10 min，弃上清，重复进行一次。沉淀中加入少量生理盐水，搅碎沉淀，加生理盐水至10 mL，3000 rpm离心10 min，弃上清并晾干沉淀，加入0.5 mL×MLB溶液，37 ℃水浴过夜消化。转移液体到EP管，加入0.5 mL酚25：氯仿24：异戊醇1混合液混匀，3000 rpm离心10 min，吸取上清液到新的EP管。加入0.5 mL氯仿混匀，3000 rpm离心10 min，吸取上清液到新的EP管，重复该步骤。在上清中加入1.0 mL提前-20 ℃预冷的无水乙醇，混匀可见絮状物质析出，4 ℃ 12 000 rpm离心20 min，小心弃去上清。用1 mL -20 ℃预冷的70%乙醇清洗沉淀两次，离心10 min 13 000 rpm/次，小心弃去上清。室温干燥，加入70 μL TE缓冲液，充分溶解后-20 ℃或-80 ℃保存备用。

1.3.3 PCR基因扩增和分析 SORLl基因表达检测和rs2282649位点基因多态性分析方法按参考文献[4]的方法进行。PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，检测达标后送深圳华大基因应用单碱基多位点微测序法（snaPshot）检测SORLI基因和rs2282649位点单核苷酸多态性的表达分布情况。

1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料采用（±s）表示，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。运用Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性，用比数比（OR）值及其95%可信区间（95%CI）来评价相对风险。

2 结果

以Hardy-Weinberg平衡法检验LOAD组和对照组的基因型频率，等位基因的分布具有群体代表性（P>0.05）。rs2282649单核苷酸多态性基因型及等位基因频率分布见表1，两组的3种基因型频率分布比较差异有统计学意义（P=0.007），两组的两种等位基因频率分布比较差异有统计学意义（P=0.019）。SNP24基因型两组间分布差异有统计学意义（P<0.05），SNP24基因型C等位基因频率与AD患病相关（0R=1.528，95%CI为0.872～2.116，P<0.05）。

表1 两组的SORL1基因SNP24基因型和等位基因频率的分布

3 讨论

阿尔茨海默病分为早发性AD（EOAD，Earlyonset AD）和迟发性AD（LOAD），LOAD又称为散发性AD，是由遗传因素和环境因素共同作用的多基因病[7]。LOAD的易患基因—载脂蛋白E（ApoE）20年来是唯一被公认的，随着科技的发展，逐渐被打破，新的基因组被发现和证实：染色体2q11.3区域的桥连整合蛋白1基因（Bridging Integrator protein-1，BIN1）、染色体8p21-p12区域的簇连蛋白基因（CLU，Clusterin）、染色体1q32.1区域的补体受体1基因（CRI，Complement Receptor1）、染色体11q14.2区域的磷脂酰肌醇结合网格蛋白装配蛋白基因（PICLM，Phosphatidylinositol-binding clathrin assemblly）、 染 色体（1lq23.2-q24.2）区域的分拣蛋白相关受体1基因（SORLl）等，其中SORL1被认为是既ApoE之后的第二易患基因[3，8-12]。因此对于SORL1的进一步研究可了解LOAD的发病机制，为AD的早期发现和诊断提供证据。

国内外对于SORL1已经进行了诸多研究，但是对于SORLl区域上rs2282649位点的研究较少，尤其是对国内人群的研究鲜有报道[13]。国内学者研究了SORLl基因5’端的SNP 8（rs668387）和3’端的SNPl9（rs2070045）、SNP23（rs3824968）和SNP24（rs2282649）共4个位点进行了研究，除了rs2070045位点的基因型和等位基因频率在遗忘型轻度认知功能障碍（aMCI，amnestic Mild Cognitive Impairment）人群和正常对照人群中有显著差异外，其余3个位点未见差异[4]。MCI是正常老年人向老年痴呆的过渡阶段，相当一部分aMCI患者会加重为AD，这在一定程度上说明rs2282649与LOAD之间的关联性不明确。然而，Lee等[14]在美国华盛顿大学医学院（Wu）提供的病例组中对SORL1基因的10个独立的单核苷酸位点研究发现，SNP24即rs2282649位点与AD患病率之间具有关联，其中“TT”“TC”和“CC”基因型在WU病例组中分别为35、146和160例，而在对照组中为26、128和191例，差异有统计学意义（P<0.01）。并且Ning等[15]也发现rs2282649等位基因频率在汉族人群中晚发型AD与正常对照组间差异有统计学意义。本研究中通过对江西地区汉族人群SORL1基因和其rs2282649位点进行研究发现，江西地区汉族人群中SORL1基因和其rs2282649位点与LOAD具有相关性，等位基因C的频率在LOAD组和对照组中比较差异有统计学意义（P<0.05），提示等位基因C是独立风险等位基因。由于SNP24位于SORLl基因的内含子区域，不进行基因表达，因此这个多态性位点很可能并不影响靶基因的氨基酸序列和蛋白结构，但可能通过连锁不平衡作用影响编码蛋白质的功能或通过调控信使RNA间接影响基因表达水平，这表明进一步研究SORL1基因和其rs2282649位点对AD的发病机制是有必要的。

综上所述，SORL1基因与江西地区汉族人群LOAD的发生相关，其中rs2282649位点单核苷酸多态性占据重要作用，C等位基因为危险等位基因。并且本研究基因分型方法不同和研究对象（江西汉族人群）的局限性也可能是造成结果差异性的原因。因此对于SORL1基因和其rs2282649位点与LOAD之间的相关性及明确机制分析还需要国内多中心、大样本的联合研究。

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A Research about SORL1 Gene Expression and rs2282649 Polymorphism Associated with Late-onset Alzheimer’s Disease

WANG Jian，YANG Jun-ping.//Medical Innovation of China，2015，12（33）：001-003

Objective：To analyze the association between SORLl and rs2282649 polymorphisms of LOAD in Jiangxi Han population.Method：A case-control study was performed and all subjects’ peripheral genomic DNA was extracted.RT-PCR was applied to amplify DNA and then the expression and distribution of SORL1 gene and rs2282649 were detected through snaPshot in BGI Shenzhen.Result：The genotype and allete of LOAD group and normal control group had group representation （P>0.05）.The genotype of TT， TC and CC of LOAD group were respectively 80 cases（59.3%），35 cases（25.9%） and 20 cases（14.8%）；and in 187 cases of the control group of those were respectively 64 cases（34.2%），75 cases（40.1%） and 48 cases（25.7%）.There was significant difference of the distribution of genotype and allele frequency between the two groups（P<0.05）.The frequencies of the allele C of two groups had significant difference（ 字2=5.402，P=0.019，OR=1.528，95%CI=0.872-2.116）.Conclusion：SORL1 gene is associated with the occurrence of LOAD in Han population of Jiangxi province and rs2282649 single nucleotide polymorphism plays an important role，C allele is the risk allele.

Alzheimer's disease；SORLl gene；Single nucleotide polymorphisms

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.33.001

2015-07-12） （本文编辑：周亚杰）

2013年度江西中医药大学校级课题（2013ZR006）

①江西中医药大学附属医院 江西 南昌 330006

王健

First-author’s address：The Affiliated Hospital of Jiangxi University of TCM，Nanchang 330006，China