甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌对万古霉素药物敏感性试验的方法学比较

郭 燕， 蒋晓飞， 朱德妹， 胡付品， 陈渊成， 吴 湜， 杨 洋

·论著·

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌对万古霉素药物敏感性试验的方法学比较

郭 燕， 蒋晓飞*， 朱德妹， 胡付品， 陈渊成， 吴 湜， 杨 洋

目的 比较不同药敏试验方法测定万古霉素对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)抗菌活性的影响。方法 收集2013年临床分离的61株MRSA，采用微量肉汤稀释法、琼脂稀释法和E试验法对MRSA进行万古霉素药敏试验的测定。根据CLSI 2014年版标准进行结果判断。采用SPSS软件对3种药敏试验所得万古霉素最低抑菌浓度(MIC)值进行分析。结果 MRSA对万古霉素的敏感率均为100%，未见万古霉素不敏感株。微量肉汤稀释法和琼脂稀释法测定万古霉素对MRSA的MIC50和MIC90值均为1 mg/L，采用E试验法测定的MIC50和MIC90值均为1.5 mg/L。3种药敏试验得到的MIC几何平均值分别为1.01(微量肉汤稀释法)、0.96(琼脂稀释法)和1.30(E试验法)。结论 3种药敏方法检测MRSA对万古霉素的敏感性结果虽一致，但由于万古霉素MIC值的细小差异在临床疗效上有着显著差异，故实验室为临床提供万古霉素药敏试验结果时，需要明确指出采用的具体药敏试验测定方法。

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌； 万古霉素； 微量肉汤稀释法； 琼脂稀释法； E试验法； 药物敏感性

万古霉素为治疗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(金葡菌)(MRSA)感染的首选药物[1]，但随着万古霉素在临床应用不断增多，已经出现对万古霉素敏感性降低的MRSA菌株[2-3]。文献报道，药敏试验方法学可以影响万古霉素对金葡菌的最低抑菌浓度(MIC)值[4]。本实验采用微量肉汤稀释法、琼脂稀释法和E试验法测定万古霉素对61株临床分离MRSA的MIC值，并对3种方法获得的结果进行比较分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细菌 收集2013年上海市和全国13所医院临床分离的MRSA 共61株，剔除同一患者相同部位重复菌株。细菌主要分离自血液(77.0%)、胸腹水(18.0%)、胆汁(4.9%)等无菌体液标本。所有细菌均于-80 ℃保存，待试验开始时取出，复苏和转种各1次后进行试验。

1.1.2 抗菌药物 万古霉素标准品购自中国食品药品检定研究院技术服务部。万古霉素E试验条系法国生物梅里埃公司产品，测定的浓度范围为 0.016～256 mg/L。

1.1.3 培养基 琼脂稀释法和E试验法所用Mueller-Hintor琼脂(MHA)为OXOID公司产品。微量肉汤稀释法所用阳离子调节肉汤(Cation Adjusted Mueller Hinton Broth, CAMHB)为BBL公司产品。

1.1.4 DensiCHEK plus比浊仪 系法国生物梅里埃公司产品。

1.1.5 质控菌株 金葡菌ATCC 29213为本研究所菌种库保存菌株。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验方法

1.2.1.1 微量肉汤稀释法 按2012年美国临床实验室标准化协会(CLSI)M07-A9(需氧菌的抗菌药物稀释法敏感性试验第9版)[5]推荐的微量稀释法进行。96孔U底微量板，每孔培养液终体积为100 μL，设置细菌生长孔和空白对照孔。万古霉素浓度分别为0.06～32 mg/L，细菌接种菌量为105CFU/mL。经35 ℃24 h培养后,用观察辅助器读取结果。要求细菌生长孔U型底中出现≥2 mm受试菌生长菌斑，空白对照孔未见细菌生长。受试菌株未见生长的最低一孔万古霉素浓度即为万古霉素对MRSA的MIC值。

1.2.1.2 琼脂稀释法 按2012年CLSI M07-A9推荐的琼脂稀释法进行。万古霉素受试浓度同微量肉汤稀释法，接种菌量为104CFU/点，同时设置无抗菌药物对照生长平皿。35 ℃24 h培养后,肉眼观察细菌生长，读取结果。要求无抗菌药物对照生长平皿上受试菌生长良好。读取含药平皿中未见细菌生长最低药物浓度即万古霉素对MRSA的MIC值。

其实，何良诸没有被案子缠上，是狗仔记者嗅到他的。记者跟他掏弄事件背景，何良诸算他妈什么背景。何良诸至今不明案情。刚才，文化厅领导通知他去公安厅。领导没有多讲什么，何良诸没有多问什么。赵集怎么样了？！

1.2.1.3 E试验法 按2012年CLSI M02-A11(纸片法抗菌药物敏感性试验第11版)[6]推荐的方法进行。0.5麦氏浊度的MRSA菌液涂布于4 mm厚的MH平皿，待琼脂吸收后用无菌镊子贴上万古霉素E试验条。35 ℃24 h培养后，E试验条与抑菌圈相切的药物浓度标注线即为万古霉素对MRSA的MIC值。

上述3种药敏试验方法为菌液调配好后在同一时间内操作完成。

1.2.2 统计分析 按2014年版CLSI M100-S24[7]描述的万古霉素对金葡菌的折点(敏感≤2 mg/L，中介4～8 mg/L，耐药≥16 mg/L)进行药敏结果判断。

2 结果

2.1 万古霉素药敏试验

3种药敏试验方法测定结果显示，万古霉素对61株MRSA的MIC值均≤2 mg/L，细菌敏感率均为100%，见表1。微量肉汤稀释法和琼脂稀释法所得万古霉素MIC值范围均为0.5～2 mg/L，MIC50和MIC90值均为1 mg/L；而E试验法得到的万古霉素MIC 值范围为0.75～2 mg/L，MIC50和MIC90值均为1.5 mg/L。微量肉汤稀释法和琼脂稀释法测定万古霉素抑制MRSA生长的MIC值的众数为 1 mg/L，MIC几何平均值分别为1.01和0.96； E试验法测定的MRSA的MIC值众数为1.5 mg/L，MIC几何平均值为1.30。当万古霉素MIC值=1 mg/L 时，微量肉汤稀释法、琼脂稀释法、E试验法对MRSA累积百分敏感率分别为95.1%(58株)，91.8%(56株)和36.1%(22株)。见表2。

2.2 3种药敏试验方法的MIC值趋势比较

采用SPSS软件绘制万古霉素对61株MRSA的MIC值柱状图，MIC值集中分布趋势的排序为: 微量肉汤稀释法>琼脂稀释法>E试验法，3种方法显示MIC值为1 mg/L的细菌占总体构成比依次各为91.8%、77.0%和27.9%。E试验法显示MIC值为1.5 mg/L的细菌达到54.1%。见图1。

表1 3种方法测定61株MRSA对万古霉素的敏感性

表2 3种方法测定万古霉素对61株MRSA的MIC值分布和累积百分敏感率

(A) broth microdilution method, (B) agar dilution method, (C) E-test.

3 讨论

金葡菌，尤其MRSA是医院获得性感染的重要病原菌之一。2013年上海市和中国CHINET监测网[8-9]的报道中金葡菌的检出率分别为10.42% 和9.61% ，分别占全年分离细菌的第3和第5位；在革兰阳性菌中居首位。MRSA的检出率分别占金葡菌的50.8%和45.2%。万古霉素一直以来均作为MRSA感染的首选药物[1]。

Prakash 等[10]采用微量肉汤稀释法、琼脂稀释法和E试验法比较了101株MRSA的MIC值，E试验法测定的万古霉素MIC值有89%～98%为1.5～2 mg/L，而琼脂稀释法和微量肉汤稀释法测定的MIC值仅有3%～12%为2 mg/L。本组资料显示E试验法测定万古霉素对金葡菌的MIC值众数为1.5 mg/L(54.1%)，MIC几何平均值为1.30；而微量肉汤稀释法和琼脂稀释法所得的万古霉素MIC值众数均为1 mg/L(所占比例分别为 91.8%和77%)，MIC几何平均值分别为1.01和 0.96，与文献报道一致[10-12]。本文中万古霉素MIC值结果根据CLSI的判断显示均为敏感，3种药敏试验方法数值上无大差异；但是由于微量肉汤稀释法和琼脂稀释法中抗菌药物的浓度采用的是几何级数稀释,一种倍比率为2的对倍稀释方法。商品化的E试验条上的药物浓度则是算术稀释，其各个浓度间的差异比几何稀释的浓度更小。所以如果根据MIC值众数(1 mg/L、1 mg/L和1.5 mg/L,P<0.01)和MIC几何平均值(1.01、0.96和1.30,P<0.01)来判断，显示3种药敏试验方法或多或少存在一定的差异。Soriano等[13]指出，根据众多药效学的研究，万古霉素浓度曲线下面积/MIC比值(AUC/MIC)是预测临床万古霉素治疗金葡菌感染疗效的最佳方法。当万古霉素MIC值为2 mg/L时得到的最佳AUC/MIC要比万古霉素MIC值为1 mg/L 时的最佳AUC/MIC低，这就说明药敏结果即使有正负一个稀释度的差异，也会影响AUC/MIC，以致临床疗效上的差异。

由于万古霉素纸片法药敏试验抑菌圈直径相似，无法区分万古霉素敏感金葡菌(VSSA)和万古霉素中介金葡菌(VISA)，故CLSI 2009年取消纸片法，建议采用稀释法进行万古霉素对金葡菌的药敏试验[14]。本组资料提示，采用不同的药敏试验方法得到的万古霉素MIC值敏感范围是不一样的。对于采用稀释法的药敏试验方法，MIC值结果可以有正负一个稀释度的浮动[10]。万古霉素MIC值的细小差异，在临床疗效上有着显著差异，因此，在为临床提供万古霉素药敏试验结果时，需要明确指出采用的具体药敏试验方法，以避免因方法学不同而带来的疗效差异。

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Susceptibility of methicillin-resistantStaphylococcusaureusto vancomycin tested by three methods

GUO Yan, JIANG Xiaofei, ZHU Demei, HU Fupin, CHEN Yuancheng, WU Shi, YANG Yang

. (Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai 200040, China)

Objective To investigate the effect of different testing methods on the susceptibility of methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) to vancomycin. Methods Sixty-one strains of MRSA were identified from clinical specimens in 2013. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of MRSA strains to vancomycin were determined by broth microdilution, agar dilution and E-test methods, simultaneously. Results were analyzed according to the Clinical and Laboratory Standards Institute 2014 breakpoints. SPSS software was used to compare the MIC values obtained by three testing methods. Results All the MRSA strains (100%) were susceptible to vancomycin reported by any of the three testing methods. MIC50and MIC90values of vancomycin against MRSA were 1 mg/L by broth microdilution and agar dilution methods, and 1.5 mg/L by E-test method. The geometric mean MIC value was 1.01 by broth microdilution method, 0.96 by agar dilution method and 1.30 by E-test. Conclusions All MRSA strains are susceptible to vancomycin tested by any of the three testing methods. The testing method should be stated clearly when laboratory provides the result of vancomycin susceptibility.

methicillin-resistantStaphylococcusaureus; vancomycin; broth microdilution method; agar dilution method; E-test method; antimicrobial susceptibility

国家科技部“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX 09303004-001)；复旦大学附属华山医院2012年院内启动基金(院471)。

复旦大学附属华山医院抗生素研究所，卫生部抗生素临床药理重点实验室，上海 200040；*检验医学科。

郭燕(1982—)，女，硕士研究生，主管技师，主要从事新抗菌药物药效学和细菌耐药性研究。

朱德妹，E-mail:zhu_dm@fudan.edu.cn。

R378.11；978.1

A

1009-7708(2015)04-0341-04

2015-02-05

2015-02-26