皖北地区优良大豆根瘤菌的筛选

吴 萍，何庆元，李正鹏，史 钧，祝嫦巍

(安徽科技学院 应用微生物研究所， 安徽 凤阳 233100)



皖北地区优良大豆根瘤菌的筛选

吴 萍，何庆元，李正鹏，史 钧，祝嫦巍

(安徽科技学院 应用微生物研究所， 安徽 凤阳 233100)

利用采集于皖北不同地区分离获得的14株大豆根瘤菌与大豆品种“南农1138-2”进行匹配试验。结果表明，根瘤菌菌株AHM2B、ABL9-2 、AWL26和AFL15与 “南农1138-2”有较好的共生性，其中菌株AHM2B、ABL9-2对总根瘤数、根瘤干重、植株干重、株高的影响较大，菌株AWL26和AFL15对提高叶绿素含量和全氮量影响显著。综合试验结果认为以AHM2B和ABL9-2较其他菌株表现更为突出。

大豆;根瘤菌;筛选;共生固氮

根瘤菌是一种分布在土壤中的革兰氏阴性细菌[1]。它侵入大豆根部后形成根瘤，与大豆植株构成了共生固氮体系，大豆为根瘤菌的生长提供所需营养和微环境，根瘤菌通过固定空气中氮为大豆生长提供氮源[2-3]。豆科植物与根瘤菌构成的固氮体系是生物固氮重要的组成部分，其体系所固定的氮约占生物固氮总量的的65%[4-7]。目前生物固氮在很多国家应用，其中美国、阿根廷和巴西等国应用的最为广泛，获得了巨大的利益[8]。巴西是最早进行大豆根瘤菌筛选计划的国家，也是受益最大的国家[10]。但是，在我国由于地域和品种的差异导致了大豆植株与根瘤菌的匹配性不高，结瘤率和固氮能力很弱，根瘤菌菌剂的使用效果很不理想[11]。所以能够筛选出适合不同地域使用的根瘤菌的意义重大。黄淮海地区是我国大豆的主产区之一，产量占全国的30%以上[12]。皖北地区大豆的种植面积和产量在黄淮海地区都占很大比重，筛选出与该地区匹配率高的根瘤菌对该地区农业发展有很大的促进作用。生物固氮具有很好的应用前景和广大的发展空间。本研究通过对“南农1138-2”大豆品种进行蛭石盆栽试验，比较供试根瘤菌株的结瘤能力、固氮能力和竞争结瘤能力，从中筛选出与该品种相匹配的优良固氮菌株。以期为根瘤菌菌肥的推广和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 供试的14株根瘤菌是从皖北不同地区分离所得。菌种名称、编号及来源详见表1。

表1 供试菌株一览表

1.1.2 供试大豆品种 供试大豆品种为南农1138-2。

1.1.3 供试蛭石 由安徽科技学院生物技术实验室提供(用1%的盐酸浸泡48h，然后用自来水清洗10遍，直至pH接近中性)。把蛭石装入高温灭菌袋中在121℃条件下灭菌2h，得到无菌蛭石。

1.1.4 培养基 ①斜面培养基(YMA培养基)：甘露醇10g，酵母粉1g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，K2HPO40.5g，琼脂粉15～18g，水1000mL，pH6.8，在121℃下，灭菌20mim；②液体培养基(YMAB培养基)：甘露醇10g，酵母粉1g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO40.5g，NaCl 0.1g，1000mL，pH6.8，在121℃下，灭菌时间为20min。

1.1.5 Fahraeus无氮营养液 CaCl2·2H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.12g，KH2PO40.1g，Na2HPO40.15g，柠檬铁盐 5mg，Gibson 微量元液 1mL，蒸馏水 1000mL, pH 6.5～7.0，在121℃下，灭菌20min。(Gibson 微量元液配方：H3BO32.86g，ZnSO4·7H2O 0.22g，MnSO4·4H2O 2.03g，NaMOO4·2H2O 0.126g，CuSO4·5H2O 0.08g，蒸馏水 1000mL)。

1.2 方法

1.2.1 根瘤菌培养 将根瘤菌接种到固体YMA斜面培养基上活化，然后转接在YMAB液体培养基中，用摇瓶培养法在28℃,160 r/min条件下，震荡培养3～4d，备用。

1.2.2 种子萌发蛭石灭菌 将精选的大豆种子首先用95%的乙醇处理5mim，再用0.1%升汞处理5min，无菌水冲洗7～8次，铺平与内含无菌滤纸和少量无菌水的培养皿中，28℃催芽1～2d，待幼根长至1cm左右时栽植。将蛭石包入耐高温塑料袋中扎好放到高压灭菌锅中灭菌(121℃)2h备用。

1.2.3 大豆栽培 将发芽的大豆根部朝下，用无菌镊子夹取，植入装有无菌蛭石的塑料花盆(15cm×13cm)中，每盆种植3颗，然后将大豆移到温室大棚中进行培养。每隔2～3d浇一次无菌水，并且按每个塑料盆10mL的量浇无氮营养液(以后随着植株的生长，适量的增加浇无氮营养液的量)。待大豆长出第一片子叶时，再沿各植株根部加入根瘤菌液2mL，各个处理设3个重复，以不接菌种作为空白对照，培养40d进行规定指标测定。

1.2.4 接种效果的测定 待植株长到40d后进行收获。收获时把根部用清水洗干净，分别测定根瘤数、根瘤干重、植株的干重(先在烘箱中120℃杀青40mim，然后在60℃烘干48h，称重[13])、植株株高，采用凯氏定氮法测定地上部分植株的全氮量[14]，并对植株的叶绿素含量进行测定[15]。

1.2.5 数据分析 利用DPS1.3软件的邓肯氏新复极差法(SSR)和Excel软件对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 接种不同根瘤菌对大豆生长的影响

注：同列数值后不同小、大写字母分别表示处理间差异达5%和1%显著水平。

Note：Values followed by different small and capital letters in the same column mean significant at the 5% and 1% levels，respectively。

由表2可以看出，14株根瘤菌处理的植株全部结瘤，结瘤数为5～89个/盆，除AFL15和AHM6-3两菌株之外，其余12菌株处理的结瘤数明显高于CK，尤其是菌株ABL9-2、AHM2B 和AWL12-1，分别比CK增加12.7倍、10.8倍和5.4倍，达到了极显著和显著水平；处理后的大多数根瘤干重高于CK，其中接种菌株AHM2B、ABL9-2和AWL12-1的根瘤干重优于其他菌株，根瘤干重分别增加5.3、5.04和4.24倍；对植株干重影响较显著的菌株依次是ASF17、AWL26、ABL9-2和AHM2B，分别比空白对照增加1.27、1.24、1.23和1.22倍；对植株株高影响较显著的菌株是AHM2B、AFFZC7、ABL9-2和AWCS13-4，植株分别增高1.31、1.30、1.30和1.29倍。

从上述分析可以看出：接种根瘤菌能够促进植株的生长，提高植株的结瘤能力，其中AHM2B和ABL9-2两种菌株的效果较好。

2.2 接种不同根瘤菌对植株叶绿素含量和全氮量的影响

表3 接种不同根瘤菌对植株叶绿素含量和全氮量的影响

注：同列数值后不同小、大写字母分别表示处理间差异达5%和1%显著水平。

Note：Values followed by different small and capital letters in the same column mean significant at the 5% and 1% levels，respectively。

由表3可以看出：接种后植株叶片中叶绿素含量差异很大，与CK比较AWL26、ABL9-2、AHM2B、AFL15 4种菌株处理后植株的总叶绿素含量增加显著，尤其是菌株AWL26、ABL9-2达到了极显著水平。 说明这些菌株与植株的匹配性较好，能够增加植株叶绿素含量，提高光合作用效率；接种不同根瘤菌对大豆植株中的全氮量的影响存在显著差异。所有经过菌剂处理的大豆植株全氮量均高于CK。AWL26、AFL15和AHM2B、 ABL9-2处理后的大豆植株全氮量比CK高3.18、2.76、2.72和2.28倍，达显著水平，有的甚至达到了极显著水平，ASF17和AWL6-4B处理后的大豆植株全氮量也比CK高1.9和2.04倍，其余菌株处理后的大豆植株全氮量高于CK，但增加不显著。

3 结论与讨论

大豆与大豆根瘤菌之间的共生作用，是在长期的历史进化中相互作用、相互影响，经过不断的互相选择逐渐形成的，是一个大豆根瘤菌与其宿主之间通过分子对话相互识别的过程[16]。在这个过程中，影响大豆根瘤菌与其寄主共生结瘤的因素有菌株、大豆品种、环境温度、湿度、pH、竞争等[17-20]。据研究表明，根瘤菌的接种率高低主要取决于自身的竞争能力，竞争能力强的菌株才能充分发挥接种的效果，固氮能力也就相应的越强[21]。另外不同接种方式也影响固氮体系的构建[22-23]。因此，共生固氮体系的作用能否充分发挥取决于多种因素的影响。在农业生产实践中，用根瘤菌剂接种豆科植物，不仅能够减少含氮肥料的使用，减少农业生产成本，还可以减少环境污染，符合现代化农业的发展需求。所以要充分发挥高效共生固氮菌在农业生产实践中的经济价值和生态效益，前提是筛选出高效的根瘤菌。为了得到匹配性更高的根瘤菌，还需要进一步关注和研究。

接种高效大豆根瘤菌能够增加大豆根瘤数量和固氮量, 增加大豆生长各个时期的氮素供给量, 增加大豆植株干物质的积累, 最终达到使大豆增产的目的[24]，从以上各项试验结果可以看出, 用于本试验的大豆根瘤菌菌株, 都能与皖北地区种植面积比较广的大豆品种“南农1138-2”进行共生匹配、结瘤固氮, 但固氮结瘤的能力和对植物生长的促进作用, 却存在着较大的差异。通过盆栽比较试验，证明在供试的14 个大豆根瘤菌菌株中, AHM2B、ABL9-2 、AWL26和AFL15这4株大豆根瘤菌，在与 “南农1138-2”进行的最佳共生匹配试验中，均表现出了良好的共生固氮结瘤效果, 接种它们的大豆植株在株高、结瘤数、瘤干重、植株地上部分干重、叶绿素含量和全氮量等指标上, 均明显地优于接种其他根瘤菌菌株, 尤其是菌株AHM2B和ABL9-2，各方面性能都比较优良。

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Screening of Superior Soybean Rhizobial Strains in Northern Anhui Province

WU Ping， HE Qing-yuan，LI Zheng-peng， SHI Jun，ZHU Chang-wei

(Institute for Applied Microbiology, Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China)

Symbiotic relationship between “Nannong 1138-2” and fourteen soybean rhizobia strains isolated from northern Anhui province was experimented. The results showed that they had the better matching between strains of AHM2B, ABL9-2, AWL26 and AFL15 and Nannong 1138-2. Thereinto, total nodule number, nodule dry weight, plant dry weight and plant height were greatly influenced by inoculated strains AHM2B and ABL9-2. Chlorophyll and total nitrogen content were significantly increased by inoculated strains of AATB26and AFL15. To sum up, two strains of AHM2B and ABL9-2 show better symbiotic relationship than other strains.

Soybean；Rhizobium；Screening；Symbiotic nitrogen-fixing

2015-05-10

安徽省教育厅自然科学基金项目(KJ2011Z066)；安徽科技学院自然科学基金项目(ZRC2013367)；安徽科技学院生物学重点建设学科项目(AKXK20102-1)。

吴萍(1958-)，女，安徽省五河县人，教授，主要从事生物肥料研究。

S565.1

A

1673-8772(2015)04-0018-05