HPLC法同时测定羚羊感冒口服液中牛蒡苷和连翘苷的含量

汪玉萍，郝自新

(安庆市食品药品检验中心，安徽 安庆 246001)



HPLC法同时测定羚羊感冒口服液中牛蒡苷和连翘苷的含量

汪玉萍，郝自新*

(安庆市食品药品检验中心，安徽 安庆 246001)

目的： 建立HPLC法同时测定羚羊感冒口服液中牛蒡苷和连翘苷的含量。方法：采用安捷伦 C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，流动相：乙腈-水(25：75)，流速：1.0mL/min,检测波长：280nm，柱温：30℃。结果：牛蒡苷在0.71～4.26μg之间线性关系良好，r=0.9996，连翘苷在0.0838～0.5028μg之间线性关系良好，r=0.9995，牛蒡苷的平均回收率为98.50%,RSD=1.06%，连翘苷的平均回收率为98.14%，RSD=0.83%。结论：试验表明，该方法操作简单，分离效果好，灵敏度高，可以用于羚羊感冒口服液的质量控制。

羚羊感冒口服液；牛蒡苷；连翘苷；高效液相色谱

羚羊感冒口服液是由羚羊角、牛蒡子、金银花、连翘等十味药制成的复方制剂，具有清热解表的功效。用于伤风咳嗽，流行性感冒，头晕发热，咽喉肿痛[1]。该制剂中牛蒡子具有疏散风热，宣肺透疹，解毒利咽的功效；连翘具有清热解毒，消肿散结，疏散风热的功效。连翘苷和牛蒡苷分别为连翘和牛蒡子的特征性有效成分[2-3]，因此连翘苷和牛蒡苷可作为羚羊感冒口服液的标志性成分之一；现行标准中采用薄层色谱扫描法仅测定牛蒡苷的含量[1]，但薄层色谱扫描法操作繁琐，影响因素多，专属性较差，误差大。为了更好的、更全面的控制药品内在质量，保证临床疗效。本文建立了高效液相色谱法同时测定羚羊感冒口服液中连翘苷和牛蒡苷含量的方法，为制定更加严格的羚羊感冒口服液质量标准提供依据。

1 材料与方法

安捷伦 1260高效液相色谱仪(G1329B自动进样器、G1314A型四元梯度泵、G1314B紫外检测器、Agilent色谱工作站，美国Agilent公司)；METTER-AE240 电子天平(瑞士梅特勒公司)；HT-350A型超声波中药处理机(山东济宁亨通电子设备厂)；牛蒡苷对照品(批号：110819-201108，供含量测定用，纯度：94.6%)；连翘苷对照品(批号：110821-201213，供含量测定用，纯度：95.3%)；均购自中国食品药品检定研究院；羚羊感冒口服液(批号130516，130726，131116，样品都为市场抽检样品)；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其它试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦 C18柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温：30℃；流动相：水-乙腈(75:25)，流速：1.0mL/min,进样量：10μL；检测波长：280nm。牛蒡苷峰和连翘苷峰的分离度大于1.5，理论板数按牛蒡苷和连翘苷峰计算均不低于8000。

1.2.2 溶液的制备

混合对照品溶液的制备 分别精密称取牛蒡苷对照品和连翘苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.3550、0.0419mg/mL的混合对照品溶液，作为混合对照品溶液。

供试品溶液的制备 取本品，混匀，精密量取10mL，置25mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理10min，放至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

阴性对照溶液的制备 按处方组成分别制备不含连翘和不含牛蒡子的羚羊感冒口服液阴性样品，并按供试品溶液制备方法分别制备缺连翘阴性对照溶液和缺牛蒡子阴性对照溶液。

1.2.3 方法学考察与样品测定

按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下的色谱条件测定，分别对分析方法的线性关系、精密度、稳定性等项目按照分析方法要求进行考察，然后分别取3批羚羊感冒口服液样品适量，测定峰面积，按外标法计算含量。

2 结果

2.1 线性关系考察

精密量取连翘苷和牛蒡苷的混合对照品溶液2，4，6，8，10，12μL，注入液相色谱仪，按“1.2.1”项下色谱条件分析，以峰面积为纵坐标(Y)，以进样量为横坐标(X)，进行线性回归，得到回归方程。得牛蒡苷回归方程：Y=5.3189×102X+38.69,r=0.9996,结果表明，牛蒡苷进样量在0.71～4.26μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；得连翘苷回归方程：Y=6.1388×102X+5.47,r=0.9995,结果表明，连翘苷进样量在0.0838～0.5028μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2 精密度考察

吸取混合对照品溶液连续进样6次，每次10μL，按“1.2.1”项下色谱条件分析，测得牛蒡苷峰面积，RSD为0.56%；测得连翘苷峰面积，RSD为0.78%，表明仪器精密度良好。

2.3 重复性试验

精密量取同一批号样品(130516)6份按“1.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，按“1.2.1”项下色谱条件分析测定。结果牛蒡苷平均含量为0.6762mg/mL, RSD为0.79%；连翘苷平均含量为0.0726mg/mL, RSD为1.1%。表明本品测定方法重复性良好。

2.4 稳定性试验

精密量取“1.2.2”项下的供试品溶液分别在配制后0，2，4，6，8，12h，进样10μL，按“1.2.1”项下色谱条件分析测定。记录牛蒡苷峰面积和连翘苷峰面积，RSD分别为0.37%和0.89%，表明样品溶液在12h内基本稳定。

2.5 专属性试验

精密量取“1.2.2”项下的混合对照品溶液、样品溶液、阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，色谱图见图1，结果表明，供试品溶液中连翘苷和牛蒡苷保留时间与对照品溶液中连翘苷和牛蒡苷保留时间一致：且两成分均得到很好的分离；同时在连翘苷和牛蒡苷色谱峰附近阴性对照溶液无干扰。

2.6 加样回收率试验

精密量取已知含量的同一批(批号：130516，牛蒡苷含量为0.6762mg/mL；连翘苷含量为0.0726mg/mL)的样品6份，每份5mL,加水补足至10mL，分别精密加入牛蒡苷和连翘苷混合对照品溶液(牛蒡苷浓度0.3550mg/mL；连翘苷浓度0.0419mg/mL，配制溶剂为甲醇)10mL，按上述供试品溶液的制备方法制备及上述色谱条件测定，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.7 样品的含量测定

样品含量测定结果见表2，牛蒡苷含量测定结果为0.6762～0.7265 mg/mL，连翘苷的含量测定结果为0.0726～0.0892 mg/mL，检测结果比较低。

表2 样品测定结果(mg/mL)

3 讨论

3.1 测定波长的选择

经紫外-可见分光光度法测定，牛蒡苷对照品在228nm,278nm处有最大吸收，连翘苷对照品在208、228、277nm处有最大吸收，再参考中国药典2010年版一部中羚羊感冒片中牛蒡苷含量测定波长和中国药典2010年版一部中连翘项下的连翘苷含量测定波长[4]，经试验牛蒡苷和连翘苷在280nm波长处都有较大吸收峰，且峰型好，无干扰，能同时测定牛蒡苷和连翘苷的含量；最后确定该试验的测定波长为280nm。

3.2 流动相的确定

在参考其它文献和中国药典2010年版一部中羚羊感冒片中牛蒡苷含量测定的流动相以及中国药典2010年版一部中连翘项下的连翘苷含量测定的流动相[4]，分别考察了不同流动相(乙腈-水系统、乙腈-0.2%磷酸系统、甲醇-0.4%磷酸系统)等，牛蒡苷和连翘苷的分离情况，经试验采用乙腈-水(25∶75)为流动相时，样品中牛蒡苷和连翘苷分离效果好，出峰时间适中，分离度达到要求，无杂质干扰，最后采用乙腈-水(25∶75)为流动相。

3.3 羚羊感冒口服液中连翘苷含量较低

高效液相色谱法测定结果显示，三批羚羊感冒口服液中连翘苷含量差异不大，但含量较低，故有必要增加连翘苷的含量测定并规定合理的最低限度，监督药品生产企业严格按照批准的生产工艺进行生产，以确保药品内在质量，保证药品的临床疗效。

4 结论

关于牛蒡苷和连翘苷的含量测定方法已有多篇文献报道[5-13],本文建立的方法简便、准确、专属性强、重复性好，为提高和完善该制剂的质量标准，更加科学有效地控制其内在质量提供了方法和依据。

[1]卫生部药品标准.新药转正标准中药第三十八册 [S].

[2]国家药典委员会.中国药典(一部)[S].

[3]王潞，赵烽，刘珂．牛蒡子苷及牛蒡子苷元的药理作用研究进展 [J].中草药，2008，39(3)：467-470.

[4]李双，王东强，李志军．连翘主要有效成分的提取与药理作用 [J].黑龙江中医药，2011，39(1)：67-70.

[5]权勤波，李启红. HPLC测定银翘解毒丸中绿原酸和牛蒡苷的含量 [J].中国药师，2013，16(10)：1510-1512.

[6]郭淑英，郝乘仪，冯波.RP-HPLC法同时测定银翘解毒丸中连翘苷的含量[J].中国药房，2009，20(24)：1896-1897.

[7]杨燕飞.HPLC法测定银翘伤风胶囊中连翘苷和牛蒡苷的含量[J].中国药事，2010,24(4):389-391.

[8]魏谭军，陈晓东.高效液相色谱法测定复方西羚解毒丸中4种成分的含量[J].医药导报，2014,33(12):1636-1638.

[9]罗云，张婧，赵海平，等.高效液相色谱法同时测定银翘散中绿原酸、连翘苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸的含量[J].中国药学杂志，2013,48(6):473-476.

[10]仇其原,邓晓文,姚立娟.HPLC-PAD法同时测定精制银翘解毒胶囊中对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘苷和牛蒡苷的含量[J].药学与临床研究,2012,20(5):402-405.

[11]陈欣，张朔生.银翘解毒丸(大蜜丸)中牛蒡苷含量的测定[J].世界中西医结合杂志，2012,7(2):115-116,154.

[12]范文莉,陈秀杰,焦太雨.HPLC法测定银翘解毒丸中连翘苷和牛蒡苷的含量[J].河南中医,2010,30(10):1025-1026.

[13]杨修镇.高效液相色谱法测定银翘片中牛蒡苷含量的方法建立[J].中国兽药杂志,2014,48(10):44-47.

Determination of Arctiin and Forsythin Contained in Lingyang Ganmao Oral Liquid by HPLC

WANG Yu-ping,HAO Zi-xin*

(Anqing Testing Center for Food and Drug, Anqing 246001，China)

Objective: To establish an HPLC method for determination of arctiin and phillyrin in Lingyang Ganmao oral liquid. Methods：The Agilent C18 (4.6mm×250mm,5μm)column was used ,the mobile phase was acetonitrile-water(25:75),the flow rate was 1.0ml·min-1,the detection wavelength was 280nm,and the coulumn temperature was 30℃.Results： The calibration curves of arctiin and phillyrin were linear respectively at the range of 0.71～4.26μg(r=0.9996),0.0838～0.5028μg(r=0.9995).The average recoveries were 98.50% for arctiin (RSD=1.06%) and 98.14% for phillyrin (RSD=0.83%).Conclusion：The method is simple and sensitive with good separation efficiency.It can be used for routine quality control of Lingyang Ganmao oral liquid.

Lingyang Ganmao Oral Liquid; Arctiin; Forsythin; HPLC

2015-05-05

安徽省药品评价监督抽检计划项目。

汪玉萍(1977-)，女，安徽省安庆市人，学士，主管中药师，主要从事药品质量分析研究。*通讯作者：郝自新，副主任中药师，E-mail:aghzx@sina.com。

R917

A

1673-8772(2015)04-0038-04