粗品肝素钠制备工艺中酶解条件的研究

宋宏新, 黄满红, 杜枘宣, 薛海燕

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)



粗品肝素钠制备工艺中酶解条件的研究

宋宏新, 黄满红, 杜枘宣, 薛海燕

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

为了研究胰蛋白酶在粗品肝素钠制备中的酶解条件，通过效价测定，在料液比、酶解时间、酶解温度、酶添加量、盐浓度、酶解液pH 6个单因素实验的基础上，采用正交试验设计来优化工艺参数.实验结果表明，酶解的最佳条件为料液比1∶8，酶解时间3.5 h，酶解温度60 ℃，酶添加量0.1%，盐浓度0.5 mol/L，酶解液pH值为8.8.

肝素钠； 胰蛋白酶酶解； 效价

0 引言

肝素是临床使用最广泛的抗凝血药物，是由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺及D-葡糖醛酸交替组成的粘多糖硫酸酯[1]，主要存在于动物内脏中的肥大细胞颗粒中，多与蛋白质结合以蛋白质-肝素复合物存在，但以小肠粘膜、肺脏中含量最丰富，医用肝素主要应用于抗凝血作用，属生物制品，主要从牛肺和猪粘膜里面提取[2].在肝素链中存在一种独特的五糖单位，可与抗凝血酶相互作用，帮助其实现抗凝血功能[3].

肝素虽在临床使用有70余年的历史，但到目前为止还没有一种能完全替代它的产品，所以它仍然是目前最重要的抗凝血和抗血栓的生化药物之一[4].此外，随着研究的进展，发现肝素还具有澄清血浆脂质、降低血胆固醇和增强抗癌药物等作用[5]以及抗炎、抗过敏、抗病毒等多种生物学功能[6].

Howell[7]在20世纪初美国生理杂志上最早发表了以狗内脏为原料的肝素提取技术.现行的肝素钠提取技术大多基于将蛋白质-肝素复合物解离，再逐步纯化游离的肝素钠分子.我国企业现多采用盐析法从猪小肠粘膜中提取肝素进行粗品肝素钠的制备，但是此方法制得的肝素分子一般抗凝血活性普遍偏低，而且产品中杂质较多，产品色泽偏黄，无法达到FDA等国际药典规定要求，针对这一问题，沈阳化工学院张万忠[8]等对肝素钠精制工艺进行了研究；陕西科技大学李红心[9]对精品肝素钠的制备及效价分析做了细致的研究.

胰蛋白酶可特异性切断蛋白质-肝素的结合位点，从而使结合的肝素分子游离出来，同时影响肝素活性的杂蛋白等物质也可被蛋白酶分解为多肽，可通过调节 pH、热变性等方法在之后的步骤中除去.然而国内开展酶解法提取肝素的时间不长，得到的产品存在诸多问题，本文将从酶解工艺参数优化等方面对肝素提取技术做相关研究.

1 材料与方法

1.1 材料

(1)新鲜猪小肠粘膜：购自西安市湖北庄市场的当天屠宰新鲜猪小肠，清洗食糜异物，再用剪刀剪成1.5～2.0米的小段，继续清洗残存食糜异物，然后再剪成20～30厘米的小段，再清洗，并用剪刀剖开清洗，而后将剖开的小肠用载玻片刮取上面的粘膜，制得新鲜猪小肠粘膜.

(2)胰蛋白酶(1∶250≥250 nfu/mg)：美国Sigma公司；肝素标准品(效价150 U/mg)：中国药品生物制品检定所；绵羊血浆：中国药品生物制品检定所.其它化学试剂为分析纯.

1.2 实验方法

(1)粗品肝素钠制备工艺：

取一定量猪小肠粘膜，经胰蛋白酶酶解过滤后，滤液用D254树脂[10]吸附，吸附后的树脂用2.5 mol/L的NaCl溶液[11]洗涤，然后用4 mol/L的NaCl溶液[12]进行洗脱，洗脱液用95%乙醇[13]沉淀，再用丙酮洗涤、沉淀，进而在60 ℃烘箱中烘干[14]即得粗品肝素钠.本实验重点研究猪小肠粘膜的酶解条件.

(2)猪小肠粘膜的酶解：以一定的料液比向大烧杯中加入经斩拌机搅拌的小肠粘膜和蒸馏水，并且在一定的时间、温度、酶添加量、盐浓度、酶解液酸碱度下恒温水浴.酶解完成后于90 ℃，5 min水浴灭酶活性，且有效杀灭有害细菌及微生物.收集酶解液，过滤后测定肝素钠活性.放置4 ℃保存.

(3)肝素钠效价测定：采用冷冻羊血浆法测定[15].估算待测样品的效价，用0.15 mol/L的NaCI溶液稀释至标准溶液(8 U/mL)相当的效价浓度，根据绵羊血浆的半凝固点分别吸取样品和标准品3到5个梯度，加1 mL绵羊血浆和0.02 mol/L的CaCl2溶液0.8 mL，置于37土0.5 ℃水浴1 h，记录每管凝结程度，按式(1)计算.

样品的效价单位=(Vstd×Cstd×V)/(Vsam×Wsam)

(1)

式(1)中：Vstd—标准品1/2凝固度的肝素加入体积(uL);Cstd—标准品溶液的浓度(U/mL);Vsam—样品1/2凝固度的肝素加入体积(uL);Wsam—样品称取的重量(mg);V—测定样品的总体积(mL).

(4)单因素实验:单因素实验在料液比(m/v)为1∶8、酶解时间为3.5 h、酶解温度为60 ℃、酶添加量为0.1%、盐浓度为0.5 mol/L、酶解液为pH 6的基础实验条件上，分别对6个单因素设置的各水平如下.

①料液比对肝素钠效价影响实验：设定小肠粘膜与蒸馏水的比(m/v)为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12；②酶解时间对肝素钠效价影响实验：选取2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h；③酶解温度对肝素钠效价影响实验：设置酶解温度45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃；④酶添加量对肝素钠效价影响实验：选取酶添加量0.02%、0.04%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%；⑤盐浓度对肝素钠效价影响实验：设置盐浓度0.35 mol/L、0.4 mol/L、0.45 mol/L、0.5 mol/L、0.55 mol/L、0.6 mol/L；⑥酶解液PH值对肝素钠效价影响试验：设定酶解液pH值7、7.6、8.2、8.8、9.4、10.

各水平酶解后测肝素钠效价.每水平重复3次,取平均值.

2 结果与讨论

2.1 料液比与效价的关系

图1为不同料液比对肝素钠效价的影响.由图1可知：当料液比较小时，因小肠粘膜黏稠度较大，不能充分地与酶液混合，导致酶解不充分，效价低.当达到料液比1∶8时，产品效价达到最高，料液比再增大时，由于水中溶解的杂质蛋白或其他大分子干扰了酶解效果，导致活性较低.因此选择料液比1∶8为最佳条件进行下一步实验.

图1 酶解料液比对肝素效价的影响

2.2 酶解时间与效价的关系

图2为不同酶解时间对肝素钠效价的影响.从图2可以得知：在一定范围内酶解程度随时间增加而增大，这是因为胰蛋白酶将与蛋白质紧密结合的肝素钠大分子裂解下来，但是到达一定时间段后，肝素钠活性却下降，这可能是因为时间过长导致肝素分子构型或结构遭到破坏，或者是因为在60 ℃条件下微生物的大量繁殖造成肝素的破坏，也有可能是因为细胞内自身存在的肝素酶作用导致肝素的裂解.所以确定酶解时间在3～4小时范围内最合适.

图2 酶解时间对肝素效价的影响

2.3 酶解温度与效价的关系

图3为不同酶解温度对肝素钠效价的影响.从图3可知：在一定范围内酶解效率随温度升高，酶活性增强，但是当温度超过60 ℃时，胰蛋白酶部分变性，不再是最适温度，从而降低了酶活力而导致蛋白质-肝素复合物未能充分解离，因而降低了酶解液中肝素钠活性.再者，温度过高会使肝素钠大分子中N-硫酸基团水解失活，也可造成效价下降，影响产品质量.所以确定最佳酶解温度在55 ℃～65 ℃之间.

图3 酶解温度对肝素效价的影响

2.4 酶添加量与效价的关系

图4为不同酶添加量对肝素钠效价的影响.由图4可明显观察到当酶添加量在0.04%时，由于浓度过低，达不到完全活性，不能将蛋白质充分解离而释放出肝素钠大分子.随酶添加量升高，效价也有所提高，在酶添加量为0.1%时，解离出的肝素钠活性达到最高，继续增大添加量时，效价有所降低，这是因为过量的蛋白酶会使肝素水解.综上以酶添加量0.1%作为最佳条件.

图4 酶添加量对肝素效价的影响

2.5 酶解液中盐浓度与效价的关系

图5为不同盐浓度对肝素钠效价的影响.由图5分析可知：盐浓度在0.5 mol/L时效价达到最高，浓度过低无法将肝素大分子充分溶解导致效价过低，浓度过高抑制了胰蛋白酶的活性且会使肝素分子溶解度降低导致效价也不高.所以选择0.5 mol/L为最佳条件.

图5 酶解盐浓度对肝素效价的影响

2.6 酶解液PH与效价的关系

图6为不同酶解液pH对肝素钠效价的影响.由图6可知：当酶解液偏中性时，酶活力较低，在pH7～9时随碱性增加胰蛋白酶达到最适酸碱度，在pH8.8时活力最高.但随着碱性继续增加，超过胰蛋白酶最适pH，则使酶失活，从而使其酶解效率下降，最终确定了酶解液pH为8.8.

图6 酶解pH对肝素效价的影响

2.7 正交实验

胰蛋白酶酶解蛋白质-肝素钠复合物工艺条件的优化：由上述单因素实验可以明显看出一般影响酶解后肝素钠效价的显著因素主要有以下三个：酶解时间、温度和酶添加量.本实验就以这三个因素为主要因素，分别取三个不同的水平，以肝素钠效价Y(U/mg)为评价指标，选用L9(34)正交表安排实验.

表1 酶解条件正交表

由正交表分析可得：肝素钠的酶解实验中，酶解时间、温度及胰蛋白酶的添加量按影响肝素活性的大小来分：时间>温度>酶添加量.并且选择出了三者的最佳配比：酶解时间3.5小时、温度60 ℃、酶添加量为0.1%.此外加之其他三个因素对于肝素钠酶解结果的影响，得出以下结论：以料液比1∶8、酶解时间3.5 h、酶解温度60 ℃、酶添加量0.1%、盐浓度0.5 mol/L、酶解液pH值为8.8为酶解肝素钠实验的最佳条件.

3 结论

本研究从料液比、酶解时间、酶解温度、酶添加量、盐浓度、酶解液pH六方面考察了其对酶解效果的影响，并以酶解时间、酶解温度、酶添加量对该酶解条件进行优化，最终得出料液比1∶8、酶解时间3.5小时、酶解温度60 ℃、酶添加量0.1%、盐浓度0.5 mol/L、酶解液pH8.8为酶解肝素钠实验的最佳条件.

由于肝素钠在动物组织中与蛋白以共价键的形式结合，需要在碱性条件下才能使其解离下来，酶解是使和肝素结合在一起的蛋白变成小分子的多肽，从而更容易与肝素分离，提取之前若将新鲜的肠粘膜变性则不但有助于蛋白的酶解,而且也可使体系中的肝素酶失活，防止在温和的酶解条件下肝素酶分解破坏肝素.所以，在酶解前可先使肠粘膜变性以更好地保护肝素的结构不被破坏，提高其效价.

酶解的效率不仅与温度、pH、酶量、时间有关，而且与酶和底物的接触面积有关，该实验中猪小肠粘膜的黏稠度较大，会直接影响酶与肠粘膜的接触面积，进而影响酶解效果，所以可通过降低肠粘膜的黏稠度来增加酶与之的接触,使其充分酶解，提高酶解效率和效价.

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Study on the enzymatic hydrolysis conditionsof the preparation for crude heparin sodium

SONG Hong-xin, HUANG Man-hong, DU Rui-xuan, XUE Hai-yan

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

To explore the best enzymatic hydrolysis conditions of heparin sodium,on the base of liquid ratio,hydrolysis time,hydrolysis temperature,enzyme dosage,salt concentration and enzymatic value of solution by potency determination and orthogonal test design to optimize the process parameters.The results indicate that liquid ratio of 1∶8,hydrolysis time 3.5 h,hydrolysis temperature 60 ℃,enzyme dosage of 0.1%,salt concentration 0.5 mol/L,enzymatic value of solution pH8.8 are the best conditions of the experiment on hydrolyzing the heparin sodium with trypsin.

heparin sodium; enzymatic hydrolysis with trypsin; potency

2015-03-10

西安市科技计划项目(CXY1348)

宋宏新(1959-)，男，陕西兴平人，教授，研究方向：生物活性物质的分离制备与检测

1000-5811(2015)03-0121-04

Q538

A