DNA条形码技术在麻蝇亚科鉴定中的应用

方义亮，张建庆，肖 武，高 博，房长天，卞玘璠，徐保海

DNA条形码技术在麻蝇亚科鉴定中的应用

方义亮1，张建庆1，肖 武1，高 博1，房长天1，卞玘璠2，徐保海3

目的 建立麻蝇亚科种类鉴定的DNA条形码技术，以期解决麻蝇亚科雌性个体无法通过形态鉴定的问题。方法 通过对福建口岸截获的黑尾黑麻蝇、黄须亚麻蝇、褐须亚麻蝇、棕尾别麻蝇、酱亚麻蝇等标本进行PCR扩增和序列测定，与BOLD上下载的88条麻蝇亚科蝇种序列进行比对，计算遗传距离、构建系统进化树。结果 5份样本扩增获得COI的长度为658 bp，在线BLAST比对结果显示相似度99%以上，遗传距离计算结果显示种内差异0～0.015 4，种间差异0.024 9～0.153 8，系统进化树显示麻蝇亚科同种能聚在一块，Bootstrap值为1 000。结论 DNA条形码技术可以作为麻蝇亚科蝇种鉴定在形态学鉴定之外的重要方法补充。

DNA条形码；COI;蝇类鉴定

麻蝇科是国境口岸医学蝇类监测的重要部分，种类繁多，全世界已知共有2 500余种，在我国也有312种[1](2003年)。麻蝇亚科系我国麻蝇科中最重要的亚科，种类也最多，与人类关系密切。麻蝇亚科的外部共同特征有：后足基节在上部后表面有细的柔毛群，有时这些毛很少是短毛或裸；腹部底色黑，无界限分明的斑，而具黑白方块相间的斑纹，即棋盘状斑。麻蝇亚科多数种类形态比较接近，形态鉴定主要依据雄虫尾器，而雌虫鉴定比较困难，另外若截获的标本残缺不全，形态鉴定便无法进行。DNA条形码技术(DNA Barcoding)是利用目的DNA片段序列区分生物物种的一种全新方法，近几年得到了快速的发展，因其能不受发育状态、性别、形态完整性影响，在昆虫鉴定方面得到广泛的应用[2]，本文通过DNA条形码技术对福建口岸常见的麻蝇亚科蝇种进行鉴定，以期在国境口岸医学媒介生物鉴定中，作为形态学鉴定之外的重要方法补充。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实物样本来源 ①黑尾黑麻蝇(Helicophagellamelanura)②黄须亚麻蝇(Parasarcophagamisera)③褐须亚麻蝇(Parasarcophagasericea)④棕尾别麻蝇(Boettcheriscaperegrina)⑤酱亚麻蝇(Parasarcophagadux)均由福建口岸采集或者截获标本。

1.1.2 虚拟样本来源 虚拟样本来自BOLD数据库(http://boldsystems.org/)，检索关键词Sarcophaginae(麻蝇亚科),以引物与本研究相同为条件，经筛选共得37个蝇种88条记录，详细见表1。

1.1.3 主要试剂和引物 昆虫基因组提取试剂盒,ExTaq、25 mmol/L MgCl2、10×buffer、2.5 mmol/L dNTP购自宝生物工程(大连)有限公司,PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物，见表2。

表1 BOLD检索数据汇总表

表2 引物

1.2 方法

1.2.1 形态鉴定 麻蝇亚科雄性蝇通过拉出尾器并固定，结合其他体表特征，参见相关书籍检索表[1]进行形态鉴定。

1.2.2 蝇虫基因组提取 取蝇虫单只蝇足清洗后，通过昆虫基因组提取试剂盒进行蝇虫基因组提取。

1.2.3 PCR扩增与产物电泳 扩增体系25 μL，其中Taq酶 0.125 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL ，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，上下引物各 0.5 μL，双蒸水15.875 μL，DNA模版1.5 μL，并按以下条件进行反应：94 ℃ 3 min预变性；94 ℃ 30 s 变性，50 ℃ 30 s退火，72 ℃ 45 s 延伸，35个循环；72 ℃ 5 min后延伸。

扩增后的产物加样置于电泳槽直流电压130 V，30 min进行电泳。电泳后置于凝胶成像系统拍照。

1.2.4 序列测定 PCR扩增产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司纯化，并用四色荧光标记双脱氧链终止法测序(AB公司DNA测序仪3730 生工生物工程公司(上海)有限公司)，测序的引物为PCR扩增引物，正反链双向测序以保证序列的准确性。

1.2.5 序列分析 1)用CodonCode软件查看测序获得的序列，去除低质量的末端序列与引物序列，并进行序列组装，将组装完成的序列保存为.fasta格式。2)在NCBI(美国国立生物技术信息中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行在线BLAST对比。3)将上述所获得的8组序列片段进行对比(ClustalW)，之后进行遗传距离计算并构建NJ树(Neighbor-joining Tree)，参数选择为Kimura双参数距离(K2P)模式，Bootstrap值为1 000。

2 结 果

2.1 蝇种基因组提取及测序结果 本次实验共提取出8个蝇种的DNA。片段核苷酸长度在750 bp左右，经过分析软件去除杂带和引物后，剩下的核苷酸片段长度为658 bp。

2.2 在线BLAST结果 见表3。其结果表明实验样品与GenBank已知序列相似度较高(>99%)，与形态鉴定结果相符合。③号样本与BLAST比对结果不一致，但实为同种异名[4]。

表3 不同蝇种在线BLAST比对结果

2.3 序列分析与遗传距离 本研究中麻蝇亚科蝇种共计39种92个体的碱基平均组成为：A=29.61%,T=36.89%,C=17.30%,G=16.20%,A+T=66.5%，具有明显的A+T倾向性。

经过计算麻蝇亚科92个不同个体的不同蝇种的遗传距离获得麻蝇亚科不同蝇种种间差异0.0 249～0.1 538，种内差异0～0.0 154(<2%)(如图1所示)，种间差异和种内差异没有交叉，表明COI(658 bp)序列能较好地对麻蝇亚科的不同种类进行鉴别，种内差异小于2%即可判断为同一种。

2.4 系统进化树构建 如图2所示，麻蝇亚科中同一种能够较好地归为一类，同时Bootstrap值都在99以上。本实验中的实物标本黄须亚麻蝇同AUSFF264-11，AUSFF268-11，AUSFF250-11聚一类，Bootstrap值为100； 褐须亚麻蝇同AUSFF319-11，AUSFF295-11，AUSFF313-11聚一类，Bootstrap值为100；棕尾别麻蝇同AUSFF082-08聚一类，Bootstrap值为100；酱亚麻蝇同AUSFF229-11，AUSFF228-11，AUSFF235-11聚一类，Bootstrap值为100，以上鉴定结果都同形态鉴定相符合。

图1 麻蝇亚科不同蝇种种间差异和种内差异

Fig.1 Interspecific and intraspecific difference of different Sarcophaginae species

3 讨 论

DNA条形码技术于2003年由Hebert[5]等提出来以后，因其有不受物种发育阶段的影响、不受物种个体特征的影响、不受物种的限制、可以鉴定出许多群体中普遍存在的隐存分类单元、获取信息量大、精确性高、操作方法简便、高效且易掌握等优点，而被广泛应用于医学媒介生物的鉴定。Cywinska等[6]对加拿大的37种蚊类进行研究，结果表明，属间差异比种间差异高近20倍，属间差异平均为10.4%，种间差异平均0.5%。张映梅等[7]对我国44种重要蚤类进行DNA条形码初步研究，结果表明，同种个体之间的同源性达到99%以上，不同种之间的同源性最高仅为90%，且几乎所有蚤类都能被DNA条形码正确鉴定。孙毅等[8]对中国硬蜱科30种重要种类进行了研究，结果表明COI基因核苷酸序列的种内差异小于3%，种间差异大于25%，且没有种间交叉，对已测定的30种蜱鉴定正确率可达到100%。本研究遗传距离计算结果显示种内差异0～0.0 154(<2%)，种间差异0.0 249～0.1 538，种内差异小于种间差异，种内差异与种间差异无交叉，结论与上述研究是一致。

从目前众多的DNA条形码技术研究来看，DNA条形码技术在生物鉴定方面具有技术可行性，很适合应用于形态学无法鉴定，或者对未知种类的鉴定，但就目前技术成本来看，DNA条形码技术所需的实验成本较高，不太适合于平时高通量的医学媒介生物鉴定，另外因为该技术对实验室的实验器材和实验人才的实验水平有一定的要求，不太适合在口岸一线做大面积推广，最后,该项技术的应用很大程度依赖于DNA条形码库的构建和扩充，而虽然目前国内外都致力于开发DNA条形码库，但仍存在库中的生物条形码有些种类欠缺的情况。总之，DNA条形码技术作为新兴的技术，目前在口岸医学媒介生物鉴定中可作为传统形态学鉴定方法的重要补充，但其发展和成熟有赖于技术进一步规范和统一，同时需要条形码库的进一步完善和补充。

图2 92种麻蝇亚科不同蝇种COI基因序列(658bp)NJ(邻接法)树

Fig.2 NJ (neighbor-joining) tree of 92 Sarcophaginae species based on COI gene fragment (658 bp)

[1]Lu BL, Wu HY. Classification and identification of important medical insects of China[M]. Zhengzhou: Henan Science and Technology Publishing House, 2003: 418. (in Chinese) 陆宝麟,吴厚永.中国重要医学昆虫分类与鉴别[M].郑州：河南科学技术出版社, 2003:418.

[2]Fang YL, Gao B, Wang YP, et al. Application of DNA barcoding in mosquito identification[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(10): 1011-1015. DOI: 10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2013.10.015 (in Chinese) 方义亮,高博,王宇平,等.DNA条形码在媒介蚊类鉴定中的应用[J].中国人兽共患病学报,2013,29(10):1011-1015.

[3]Folmer O, Black M, Hoeh W, et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J]. Mol Mar Biol Biotechnol, 1994, 3(5): 294-299.

[4]Wang D. A systematic research of sarcophagidae from China (Diptera: Muscidae)[D]. Shenyang: College of Chemistry and Life, Science, Shenyang Normal University, 2013. (in Chinese) 王迪.中国麻蝇科分类和地理分布研究[D].沈阳：沈阳师范大学化学与生命科学学院，2013.

[5]Herbert PD, Cywinska A, Ball SL, et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Biol Sci, 2003, 270(1512): 313-321. DOI: 10.1098/rspb.2002.2218

[6]Cywinska A, Hunter FF, Hebert PDN. Identifying Canadian mosquito species through DNA barcodes[J]. Med Vet Entomol, 2006, 20(4): 413-424. DOI: 10.1111/j.1365-2915.2006.00653.x

[7]Zhang YM, Wu PJ, Wang G, et al. The primary study on DNA barcoding of important Flea in China[C]//The third international forum for Stainable Management of Disease Vectors Vol. Hangzhou: CPMA, China CDC, 2010: 216-217. (in Chinese) 张映梅,吴培进,王刚,等.我国重要蚤类DNA条形码初步研究[C]//第三届媒介生物可持续控制国际论坛论文集.杭州：中华预防医学会,中国疾病预防控制中心,2010:216-217.

[8]Sun Y, Xu RM, Wang KK. Identification of ticks through DNA barcoding techniques[C]//The third international forum for Stainable Management of Disease Vectors Vol. Hangzhou: CPMA, China CDC, 2010: 227. (in Chinese) 孙毅,许荣满,王可可.中国蜱科重要种类DNA条形码鉴定技术研究[C]//第三届媒介生物可持续控制国际论坛论文集.杭州:中华预防医学会,中国疾病预防控制中心,2010:227.

Sarcophaginae identification by DNA-barcoding

FANG Yi-liang1,ZHANG Jian-qing1,XIAO Wu1,GAO Bo1,FANG Chang-tian1,BIAN Qi-fan2,XU Bao-hai3

(1.FujianInternationalTravelHealthcareCenter,Fuzhou350001,China; 2.FujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China; 3.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

In this study, we aimed to establish method for identifying Sarcophaginae by DNA-barcoding and to solve the problem that Sarcophaginae female species could not be identified by morphology. We amplified and analyzed the sequences of these samples in Fujian frontier such asHelicophagellamelanura,Parasarcophagamisera,Parasarcophagasericea,Boettcheriscaperegrine,Parasarcophagabrevicornis,Parasarcophagadux,Parasarcophagasimilis,Parasarcophagaalbiceps,ParasarcophagaPingi, andSeniorwhiteareciproca. Secondly, we aligned these sequences with 88 Sarcophaginae species loaded from BOLD. Thirdly, we estimated the genetic distances and built system evolutionary tree. The result of amplification with 5 samples showed that length of the obtained COI sequences were 658 bp. And the result of alignment on BOLD line showed that index of similarity of the same species was above 99%. The result of calculation genetic distances showed that intraspecific difference was 0-0.015 4 and interspecific difference was 0.024 9-0.153 8. Phylogenetic tree showed that the same Sarcophaginae species stayed together on value of Bootstrap 1000. It came to a conclusion that DNA-barcoding can be the important method to supplement of morphologically identifying Sarcophaginae.

DNA-barcoding; COI; identifying flies

1.福建国际旅行卫生保健中心，福州 350001； 2.福建医科大学公共卫生学院,福州 350001 3.福建省疾病预防控制中心,福州 350001 Email: anew627@163.com

Supported by the Science and Technology Plan of Fujian Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau of P.R.C (No. FK2012-12)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.016

R384.2

A

1002-2694(2015)06-0569-05

2014-08-19；

2014-12-24

福建检验检疫局科技计划项目基金(No.FK2012-12)