微孔板Alamar blue显色法检测结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性的研究

郑玉红，郭 倩,3，李 超,4，魏剑浩,4，赵丽丽，蒋 毅，赵秀芹，万康林，李桂莲

微孔板Alamar blue显色法检测结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性的研究

郑玉红1,2，郭 倩1,2,3，李 超1,2,4，魏剑浩1,2,4，赵丽丽1,2，蒋 毅1,2，赵秀芹1,2，万康林1,2，李桂莲1,2

目的 评价微孔板Alamar blue显色法检测结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性的可行性。方法 用微孔板Alamar blue显色法对78株结核分枝杆菌检测氧氟沙星的最小抑菌浓度，记录获得结果时间，利用ROC曲线确定氧氟沙星的最佳耐药阈值，并和传统的药物敏感性实验罗氏培养基比例法进行比较。结果 微孔板Alamar blue显色法获得结果平均时间为8 d，氧氟沙星的最佳耐药阈值为2 μg/mL，以罗氏培养基比例法为金标准，氧氟沙星的灵敏度和特异度分别为88.6%和94.1%。结论 微孔板Alamar blue显色法是一种简便、敏感、快速的药物敏感性检测方法，可用于结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性的快速检测。

结核分枝杆菌；氧氟沙星；耐药性；Alamar blue显色法

近年来，耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)和广泛耐药结核病(extensive drug resistant tuberculosis, XDR-TB)的出现使结核病控制面临严重的挑战。我国是一个MDR-TB高负担国家，MDR-TB病人数占全球的22%[1-3]。2007年全国结核病耐药性基线调查结果显示MDR-TB患病率初治病人为5.7%，复治病人则高达25.6%[2]。氟喹诺酮类药物对结核分枝杆菌具有高度抗菌活性，是MDR-TB联合治疗方案的药物之一，而且氟喹诺酮类药物成员莫西沙星作为一线抗结核药用于减少结核病治疗疗程的临床试验目前正在评估当中[4-5]。然而氟喹诺酮类药物由于其广谱抗菌活性，该药在我国目前广泛用于非呼吸道感染性疾病已经有20多年的历史。氟喹诺酮类药物的滥用可能会使MDR-TB的治疗效果不尽如人意。因此快速、准确的对氟喹诺酮类药物进行药物敏感性实验对指导临床治疗、控制结核病流行具有极其重要的意义。

目前临床上仍广泛采用罗氏培养基比例法药物敏感性试验检测结核分枝杆菌的耐药性，药敏结果获得需要4～5周，不能及时准确的指导结核病治疗。Alamar blue显色法药敏实验是近年兴起的表型药物敏感性检测方法，与传统的比例法相比，实验周期从4～5周缩短至8～9 d，而且操作简单，可快速测定大量样本。文献报道Alamar blue显色法药敏实验用于检测结核菌4种一线抗结核药的敏感性具有良好的灵敏度和特异度[6-10]。但是目前关于该方法检测结核菌氟喹诺酮敏感性的报道较少。现将我们用Alamar blue显色法检测结核菌氧氟沙星耐药性的结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株 结核分枝杆菌标准株(H37Rv，ATCC27294)和78株经菌种鉴定为结核分枝杆菌的临床分离株为本室保存菌株。78株临床株含经比例法药敏试验鉴定的44株氧氟沙星耐药株和34株氧氟沙星敏感株，具体的耐药表型见表1。

表1 78株结核分枝杆菌临床分离株耐药谱

Note: OF, ofloxacin; INH, isoniazid; RIF, rifampicin; STR, streptomycin; EMB, ethambutol; KAN, kanamycin; CPM, capreomycin; Pan-susceptible strains means that strains were susceptible to all of the above drugs.

1.2 试剂和耗材 Middlebrook 7H9干粉和OADC营养添加剂购自美国BD公司；利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、喹诺酮、卡那霉素和卷曲霉素购自美国Sigma公司；ALamar blue购自英国AbD Serotec公司；灭菌96孔酶标板购自美国Corning公司。

1.3 主要试剂配制 7H9液体培养基配制方法为秤取4.7g 7H9干粉、2 mL甘油，加入到898 mL蒸馏水中，于121 ℃高压灭菌10 min后置4 ℃冰箱保存。临用时，加入100 mLADC营养添加剂。Alamar blue显色剂为临用前配制。氧氟沙星用灭菌后的1%氢氧化钠水溶液配成1.28 mg/mL。

1.4 罗氏培养基药敏比例法 按照《结核病诊断实验室检验规程》进行，培养基中药物终浓度如下：利福平40 μg/mL，异烟肼0.2 μg/mL，链霉素4 μg/mL，乙胺丁醇2 μg/mL，卡那霉素30 μg/mL，氧氟沙星2 μg/mL，卷曲霉素 40 μg/mL[11-12]。

1.5 氧氟沙星MIC测定 H37Rv和78株结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星的MIC检测采用微孔板Alamar blue显色法，具体步骤参照文献[6]。简言之，先于96孔板每一行的各个孔加入100 μL7H9，然后采用倍比稀释的方法使氧氟沙星的浓度为64 μg/mL～0.125 μg/mL，同一行的各孔均加入同一菌株的稀释菌液(浓度为50 μg/mL)100 μL，一个微孔板可以做6株菌株对氧氟沙星的MIC。将上述微孔板在37 ℃的培养箱中培养5 d；从第6 d开始，在空白板中加入70 μL显色剂(Alarmar blue：5%Tween-80=2∶5)，隔天观察变色情况。如颜色从蓝色变成紫红色或粉色，则在含药培养基中加入显色剂；若没有变色或变色程度较浅，则继续在另一对照孔中加入显色剂，观察至变色为止。在含药培养基中加入显色剂的第2 d，观察结果并记录获得结果的天数。MIC定义为蓝色完全没有发生改变的最小药物浓度。

1.6 数据分析 微孔板Alamar blue显色法的准确度利用ROC曲线评价，曲线下面积越大，则认为该方法正确区分氧氟沙星耐药和敏感的能力越大。ROC曲线可给出区分耐药和敏感的最佳耐药阈值，当ROC曲线下面积为1时，该阈值可正确的将耐药和敏感完全分开，当面积小于或等于0.5时，该阈值不能将敏感和耐药分开。金标准为改良罗氏比例法。ROC数据分析采用统计软件包SPSS16.0进行。

2 结 果

2.1 氧氟沙星MIC值检测结果 78株菌株氧氟沙星的MIC值见表2。44株氧氟沙星耐药菌株中，39株菌株氧氟沙星的MIC值在2 μg/mL及以上，MIC值最高为64 μg/mL；其余5株中4株菌株MIC值为1 μg/mL，1株菌株为0.5 μg/mL。34株氧氟沙星敏感菌株中2株MIC为2 μg/mL，2株为1 μg/mL，2株为0.5 μg/mL，14株为0.25 μg/mL，其余12株≤0.125 μg/mL。

利用ROC曲线分析，曲线下面积为0.981，P值为0.000，氧氟沙星的最佳耐药阈值为2 μg/mL。此时Alamar blue显色法的灵敏度和特异度分别为88.6%和94.1%，见表3。

表2 78株结核分枝杆菌氧氟沙星MIC检测结果

Note: OF, ofloxacin.

表3 微孔板Alamar blue 显色法检测结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性的敏感度和特异度分析Tab.3 Sensitivity and specificity of Microplate Alamar blue assay for ofloxacin susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis

Note: MABA, Microplate Alamar blue assay; the breakpoint of ofloxacin resistance was ≥2 μg/mL for Microplate Alamar blue assay.

2.2 检测时间 本研究共检测78株临床菌株对氧氟沙星的耐药性，共有60株菌株8 d获得结果，12株9 d获得结果，6株10 d获得结果。平均时间(中位数)为8 d。

3 讨 论

由于结核分枝杆菌耐药问题日益严重[13]，因此快速、简便、准确的药物敏感性检测方法的出现就显得尤为重要。多个文献报道ALamar blue(刃天青)显色法检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇药物敏感性的灵敏度和特异度均在97%以上[6-10]。本研究用微孔板Alamar blue显色法测定结核分枝杆菌对氧氟沙星的最小抑菌浓度，并与罗氏比例法进行比较。

本研究结果显示，以比例法作为金标准，氧氟沙星的耐药阈值为2 μg/mL时，Alamar blue显色法的灵敏度和特异度分别为88.6%和94.1%。王芝等人用微量液体培养基MIC快速法检测220株结核菌发现灵敏度和特异度分别为90.8%和96.5%[14]。而Bactec MGIT960药敏系统检测结核菌的灵敏度和特异度分别介于71.2%～95.2%和91.5%～95.7%[15-16]。由此可见，Alamar blue显色法可以较准确的判断结核菌株的药物敏感性。此外，本方法既可以获得结核菌株的药敏检测结果，还可获得药物的MIC值，从而了解菌株的耐药水平高度，为指导临床治疗用药提供细致可靠的依据。

结核分枝杆菌是一种慢速生长菌，由此给结核病的快速诊断以及药物敏感性的快速检测带来了保碍。目前WHO推荐的用于结核分枝杆菌喹诺酮类药物耐药性诊断的方法有罗氏培养基比例法和Bactec MGIT960药敏系统，但罗氏培养基比例法获得结果的平均时间为28 d，远远高于本法需要的时间8 d，和Bactec MGIT960药敏系统的10 d差不多[15]。而Bactec MGIT960药敏系统仪器及试剂价格昂贵，限制了其在中等及资源贫乏的国家和地区的应用。然而本研究利用微孔板进行实验，对实验室设备设施以及实验人员的生物安全知识要求较高，建议在螺旋盖的培养管中进行实验以提高安全性。总之，Alarmar blue显色法是一种简便、敏感、快速、低廉的药物敏感性检测方法，可用于结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性的快速检测。

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s: Wan Kang-lin, Email: wankanglin@icdc.cn;LI Gui-lian, Email: LiguiLian@icdc.cn

Rapid determination on resistance of ofloxacin forMycobacteriumtuberculosiswith microplate alamar blue assay

ZHENG Yu-hong1,2,GUO Qian1,2,3,LI Chao1,2,4,WEI Jian-hao1,2,4, ZHAO Li-li1,2,JIANG Yi1,2,ZHAO Xiu-qin1,2,WAN Kang-lin1,2,LI Gui-lian1,2

(1.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China; 2.CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,Hangzhou310003,China; 3.PathogenicBiologyInstitute,SouthofChinaUniversity,Hengyang421000,China; 4.WenzhouMedicalCollege,KeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,Wenzhou325035,China)

We assessed the feasibility of microplate alamar blue assay for determining the ofloxacin resistance ofMycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis). MIC of ofloxacin of 78M.tuberculosisisolates was determined by microplate alamar blue assay and the time of obtaining the results was recorded; receiver operating characteristic (ROC) curve was used to determine the resistant threshold value of ofloxacin, and compared to the conventional proportional method. Results showed that the resistant threshold value of ofloxacin was 2 μg/mL for microplate alamar blue assay, and compared to the gold standard proportional method, the sensitivity and specificity were 88.6% and 94.1%, respectively. And the time obtaining the results for microplate alamar blue assay was 8 days. Microplate alamar blue assay is simple, sensitive and rapid, and is a promising alternative method for rapidly determining the resistance of ofloxacin ofM.tuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; ofloxacin; resistance; alamar blue assay

万康林，Email：wankanglin@icdc.cn； 李杜莲，Email：LiguiLian@icdc.cn

1.传染病预防控制国家重点实验室，传染病预防控制所，中国疾病预防控制中心， 北京 102206； 2.感染性疾病诊治协同创新中心，杭州 310003； 3.南华大学病原生物学研究所，衡阳 421000； 4.温州医学院，医学检验省部共建教育部重点实验室，温州 325035

Supported by the project of the National Key Program of Mega Infectious Disease (No. 2013ZX10003006-002-001)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.009

R378.91

A

1002-2694(2015)06-0537-04

2014-12-29；

2015-03-30

国家重大传染病专项课题(No.2013ZX10003002-001)，(郑玉红，郭倩有同等贡献)