新加糖肾康对高糖环境下人肾小管上皮细胞炎症因子释放的作用*

田广芳，权 卓，杨丽霞，程 涛，张定华，薛建军，孙 文，刘铜华(.甘肃省中医院，甘肃 兰州 70050； .中国人民解放军第十医院，甘肃 武威 7000； .甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 70050； .北京中医药大学教育部中医养生学重点实验室，北京 0009)

·实验研究·

新加糖肾康对高糖环境下人肾小管上皮细胞炎症因子释放的作用*

田广芳1，权 卓2，杨丽霞3，程 涛3，张定华1，薛建军1，孙 文4，刘铜华4
(1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050； 2.中国人民解放军第十医院，甘肃 武威 733000； 3.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050； 4.北京中医药大学教育部中医养生学重点实验室，北京 100029)

目的：通过观察新加糖肾康(简称TSK)对高糖环境下培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)单核细胞趋化因子蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)等炎症因子释放的作用，探讨其防治炎症介导的糖尿病肾病的作用及机制。方法：体外培养HK-2 细胞，培养基为含 10 % 胎牛血清的1640培养基，实验分为 6 组：空白对照组、高糖组(30 mmol/L D-葡萄糖)、空白血清对照组(30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清)、新加糖肾康低剂量组(30 mmol/L D-葡萄糖+5% TSK药物血清)、新加糖肾康中剂量组(30 mmol/L D-葡萄糖+10% TSK药物血清)、新加糖肾康高剂量组(30 mmol/L D-葡萄糖+20% TSK药物血清)。每组细胞在药物干预24h、48h后，ELISA法检测细胞培养上清中MCP-1、TNF-α和IL-1的含量。结果：正常培养的HK-2细胞经高糖条件培养后，炎症因子MCP-1、TNF-α和IL-1的释放显著增加，与空白对照组对比，差别有统计学意义(P<0.05)；但经新加TSK含药血清干预后，炎症因子的释放开始减少，与高糖组对比，差别有统计学意义(P<0.05)。结论：中药复方新加TSK能够抑制高糖环境下人肾小管上皮细胞炎症因子的释放，这可能是其防治糖尿病肾病的机制之一。

新加糖肾康；高糖；人肾小管上皮细胞；炎症因子；动物；大鼠

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的慢性微血管并发症之一，在糖尿病所有并发症中占主要地位。DN的防治一直是广大科技工作者的主要研究领域，但目前对于DN的发病机制尚未完全阐明。近年来，随着炎症学说在医学各领域的兴起，有关DN的炎症发病机制也逐渐引起了人们的注意。已有研究表明DN与慢性炎症相关，认为DN就是一种免疫炎症性疾病[1]。因此，增强机体免疫力，减少炎症细胞因子对肾脏组织包括肾小球、肾小管的炎症损伤已成为防治DN的新思路。糖肾康是甘肃省中医院刘国安教授和张定华主任医师经过多年的临床实践，通过多次药物筛选，经过反复论证确立的经验方，具有益气养阴、清热祛湿、活血化瘀的功效。既往研究发现：该方对2型糖尿病患者血流变学指标具有一定的改善作用，并能减少尿微量白蛋白和24 h尿蛋白定量，临床治疗DN效果良好[2]。本课题在前人研究的基础上，结合北京中医药大学刘铜华教授治疗DN的学术思想[3]，通过专家讨论，对本方进行了再次优化，形成了新加糖肾康(TSK)组方。根据DN的炎症发病机制，本研究通过观察其对高糖环境下培养的人肾小管上皮细胞单核细胞趋化因子蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)等炎症因子释放的作用，进一步阐明其防治DN的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与动物

人肾小管上皮细胞株(HK-2)购于上海斯信生物科技有限公司。雄性SPF级Wistar大鼠购于甘肃中医学院动物中心，许可证号：SCXK(甘)2004-0006。

1.2 药品、试剂与仪器

新加糖肾康由黄芪、生地黄、槐米、大黄、益母草、山楂、水蛭组成，所用中药材购于甘肃省中医院药剂科，用时水提醇沉，冷藏备用；D-葡萄糖，汕头西陇化工有限公司产品，批号0810142，用时配成30 mmol/L的溶液[4]。1640培养基、胎牛血清，均为Gibco公司产品，批号依次为1237579，12657-029；人MCP-1 ELISA试剂盒(批号E0124Hu)、TNF-α ELISA试剂盒(批号E6320Hu)、IL-1 ELISA试剂盒(批号E0077Hu)，均为上海晶天生物科技有限公司产品。MCO-18AIC型二氧化碳培养箱，SANYO公司产品；SW-CJ-2FD型超净生物安全柜，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品；IX51型倒置显微镜，Olympus公司产品；MS 352型酶标仪，Labsystems公司产品；MDF-U53V型-80 ℃超低温冰箱，SANYO公司产品；LMQ.CV型立式灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司产品。

1.3 新加TSK药物血清的制备

20只雄性Wistar大鼠饲养于甘肃省中医药研究院中药研究所动物室洁净柜中，普通饲料喂养。大鼠按照体质量排序，采用随机数据表，随机分为空白组和药物组，每组10只。药物组以新加TSK灌胃，剂量为成人临床用量的6.5倍；空白组采用同体积生理盐水灌胃。每次灌胃体积为10 μL/体质量。早、晚各1次，灌胃3 d。末次灌胃前禁食，不禁水，灌胃30 min后大鼠股动脉采血，冷冻离心，吸取血清，装入EP管中 -20 ℃保存。

1.4 HK-2细胞培养及分组

HK-2 细胞培养于 37 ℃、体积分数 50 mL/L CO2细胞培养箱中，培养基为含体积分数100 mL/L 胎牛血清的1640培养基。每天在显微镜下观察细胞生长状态，及时吸弃脱落死亡的细胞，更换新鲜培养基，以免陈旧细胞代谢产物影响细胞生长状态。当细胞生长融合达到80%以上，消化液消化细胞，显微镜下观察消化状态，待细胞脱落时用完全培养基终止消化，低速离心5 min，用新鲜培养基将细胞重悬，吹打均匀后进行传代培养。实验分为6 组。①空白对照组：由1640培养液培养。②高糖组：在1640培养液中加入30 mmol/L D-葡萄糖，对细胞进行高糖环境培养。③空白血清对照组：在高糖组的基础上，加入10%空白血清，对细胞进行干预性培养。④新加糖肾康低剂量组：在高糖组的基础上，加入5% 新加TSK药物血清，对细胞进行干预性培养。⑤新加糖肾康中剂量组：在高糖组的基础上，加入10% 新加TSK药物血清，对细胞进行干预性培养。⑥新加糖肾康高剂量组：在高糖组的基础上，加入20%新加TSK药物血清，对细胞进行干预性培养。

1.5 检测指标

采用ELISA法检测细胞培养上清中MCP-1、TNF-α和IL-1的含量。具体方法如下：将传代培养的细胞吹打均匀，接种在24孔细胞培养板中，剂量为1 mL，每组3孔，接种2板。2 h后在显微镜下观察细胞贴壁状态。培养24 h后吸弃上清。每组加入1 mL含药培养液，继续培养。培养24 h、48 h时，仔细吸取每孔细胞上清于1.5 mL的 EP管中，4 ℃离心，取上清，低温保存待测。指标检测按照ELISA试剂盒说明书进行。检测前将样本置室温慢慢融化，在反应条孔中加入标准品或待测标本，每孔剂量为100 μL。在空白对照孔加入100 μL稀释液。在37 ℃培养箱中孵育，洗涤反应板，最后加酶标抗体进行酶联免疫反应。反应终止后，以空白对照孔调零，在酶标仪450 nm处测定各孔OD值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计分析软件处理。数据以均数(x)±标准差(s)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

ELISA结果显示：HK-2细胞在高糖环境下培养24 h、48 h后，细胞培养上清中的MCP-1的含量显著增多，随之TNF-α和IL-1的含量也显著增加，在48 h时作用更加显著，与空白对照组对比，差别有统计学意义(P<0.05)。在新加TSK干预性培养后，MCP-1的释放量开始下降，进而TNF-α和IL-1的释放量也逐渐下降，并随着药物质量分数、作用时间的增加，炎症因子的释放量越来越少，在TSK高剂量、48h时效果最为显著，与高糖组对比，差别有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组HK-2细胞培养24，48 h MCP-1含量对比 ng·L-1，n=3,x±s

注：与空白对照组对比，*P<0.05；与高糖组对比，#P<0.05。

表2 各组HK-2细胞不同时间TNF-α含量对比 ng·L-1，n=3,x±s

注：与空白对照组对比，*P<0.05；与高糖组对比，#P<0.05。

表3 各组HK-2细胞不同时间IL-1含量对比 ng·L-1，n=3,x±s

注：与空白对照组对比，*P<0.05；与高糖组对比，#P<0.05。

3 讨 论

近年来，基于炎症机制探讨糖尿病肾病的研究越来越多，有动物实验，也有细胞实验，因此，DN被国内外学者称为免疫炎症性疾病[1]。研究发现，当糖尿病患者的血糖得不到很好的控制时，肾脏组织长期处在高糖环境下，高糖刺激肾小球系膜细胞或肾小管上皮细胞后，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)大量释放，引起局部组织单核/巨噬细胞及淋巴细胞被激活，肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞的单核细胞和T淋巴细胞大量迁移，出现了DN的慢性炎性反应[5]。因此，MCP-1是DN炎症反应的始因子，是肾脏整个炎症反应链条上的关键因子。慢性炎症反应的直接后果是各类炎症细胞因子的大量释放，常见的主要有核因子-κB(NF-κB)、细胞黏附分子(ICAM-1)、血管紧张素II(Ang II)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1、白介素-6(IL-6)等[5-8]。这些炎性细胞因子引起肾小管上皮细胞转分化，成纤维细胞被激活，细胞外基质成分在肾间质大量沉积，导致了糖尿病肾间质纤维化，而肾间质纤维化是各类肾脏疾病发生、发展的病理基础；因此，高血糖—炎症反应—肾间质纤维化—糖尿病肾病，形成了一条DN的炎症机制反应轴。

DN据其临床症状，既属“消渴”，又属“肾病”。古代医家所论述的消渴继发“水肿、尿浊、胀满、关格”等，皆是DN的临床表现[9]。《诸病源候论》中所言消渴“其久病变，或发痈疽，或成水疾”指的是糖尿病病久出现并发症，可能出现现代医学的糖尿病足或糖尿病肾病引发的水肿。《三消论》中又说：“夫消渴者，多变为聋盲疮癣痤疿之类或水液妄行而面上肿也”。《证治要诀》亦指出：“三消久而小便不臭，反作甜气，在溺中滚涌，更有浮溺面如猪脂，此精不禁，真元竭也”。以上古籍皆指出消渴并发肾病，从症状上不难看出其类似于现代的DN。有关DN的中医病机，古代医家的观点多集中在肾虚血瘀，主要表现为本虚标实。本虚一般指阴虚、阳虚、气虚、血虚、脾虚、肺虚、肾虚等先天禀赋不足；标实主要指痰、湿、浊、瘀等后天病理邪实。二者互为因果，相互影响。本课题所选新加糖肾康具有益气养阴、清热祛湿、活血化瘀的功效。方中黄芪、生地黄益气养阴，为君药；槐米、大黄清热祛湿，为臣药；益母草、山楂、水蛭活血化瘀，为佐药。其中水蛭为新增虫类药，加强了组方的活血化瘀作用。本方思想符合DN“本虚标实”的理论基础，这也是名老中医验方的优势特点之一：遵从中医理论，源于临床实践。

本研究结果显示：人肾小管上皮细胞在高糖环境培养下，MCP-1的释放量显著增多，TNF-α和IL-1的释放也随之显著增多，说明高糖是DN炎症损伤的主要因素。新加糖肾康药物血清干预性培养后，MCP-1的释放开始减少，进而TNF-α和IL-1的释放量也显著下降，说明新加糖肾康在一定程度上能够抑制高糖刺激的炎症因子释放，有效阻止了DN的进一步发展，这可能是其防治DN的机制之一。

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(编辑 陶 珠)

《中医研究》杂志参考文献格式

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b 期刊文章

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1001-6910(2015)12-0060-03

R587.2

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.12.29

杨丽霞，博士，副主任医师，硕士生导师，yanglixia-415@163.com

甘肃省中医药管理局中医药科学技术研究课题(GZK-2011-13)

2015-05-04；

2015-08-18