HPLC测定枣仁安神颗粒中木兰花碱含量

张 颖，姜 鸿，尤献民

(辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034)



HPLC测定枣仁安神颗粒中木兰花碱含量

张 颖，姜 鸿，尤献民*

(辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034)

目的：建立HPLC法测定枣仁安神颗粒中木兰花碱的含量。方法：采用Ultimate XB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A：0.2% 磷酸-0.2% 三乙胺水溶液，B：乙腈，梯度洗脱，检测波长278nm，流速1.0mL·min-1。结果：所建立的HPLC含量测定方法线性关系良好 (r=1)，平均回收率为104.1%，RSD=1.0%。结论：该分析方法快速、准确，重现性好，可用于枣仁安神颗粒的质量控制。

枣仁安神颗粒；木兰花碱；高效液相色谱法

枣仁安神颗粒由酸枣仁(炒)、丹参和五味子(醋)三味中药组成，具有补心养肝、安神益智的功效，主治由心肝血虚、神经衰弱引起的失眠、健忘、头晕、头痛等症[1]。文献报道[2-3]，炎症对睡眠的影响有因果关系，在炎症急性期反应中，机体能产生多种炎性细胞因子，而该过程同时伴有睡眠结构的改变[4]。前期药理研究表明，枣仁安神颗粒连续灌胃7天能显著影响小鼠全脑IL-1β和TNF-α含量。因此，本实验选用酸枣仁中具有抗炎作用的木兰花碱为指标[5]，建立高效液相色谱法测定枣仁安神颗粒中木兰花碱含量的方法。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪：四元泵、DAD 二级管阵列检测器。木兰花碱对照品(≥98%)，成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-14051706，乙腈、甲醇、磷酸、三乙胺为色谱纯；水为重蒸水；供试品(辽宁省中医药研究院药学室提供，批号分别为：20130501、20130502、20130503)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18(4.6mm×200mm，5μm)；流动相：乙腈、0.2% 磷酸-0.2%三乙胺水溶液，梯度洗脱(见表1)；流速：1.0mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：278nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取木兰花碱对照品9.2mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(木兰花碱浓度为0.092mg·mL-1)。精密吸取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0mL，置于10mL量瓶，加0.2%磷酸-三乙胺混合水溶液至刻度，摇匀，得到木兰花碱浓度为9.2、18.4、27.6、36.8、46.0和55.2μg·mL-1的对照品溶液。

表1 流动相梯度

2.2.2 供试品溶液 取批号为20130501的本品20g，研细，取1.0g，精密称定，置50mL 具塞锥形瓶中，精密加甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，过0.45μm滤膜，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方比例取药材，除去酸枣仁，按工艺制备阴性样品，按“2.2.2”项下制备阴性供试液。

2.3 系统适应性试验

精密吸取阴性供试液、供试品溶液及木兰花碱对照品溶液，分别注入液相色谱仪中，记录色谱，见图1。结果表明：阴性供试液色谱图中，在与木兰花碱对照品相同保留时间处未见相应色谱峰干扰，表明该实验方法专属性良好。

图1 木兰花碱HPLC图谱

2.4 线性关系考察

精密吸取各对照品溶液20μL，注入液相色谱仪中，以木兰花碱峰面积对其相应质量浓度作线性回归，得回归方程y=29.67x-7.087，r=1，表明木兰花碱在9.2～55.2μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取枣仁安神颗粒(批号为20130501)，制备供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积值，得木兰花碱峰面积RSD为0.3%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、8、12和24h注入液相色谱仪中，测定，计算RSD为 2.8%。表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取批号为20130501的本品20g，研细，取1.0g，平行6份，精密称定，按“2.2.2”项下实验方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪中，测定，计算RSD为2.9%，表明重复性良好。

2.8 加样回收试验

取批号为20130501的本品20g，研细，取0.5g，平行6份，分别精密加入含木兰花碱对照品的甲醇溶液20mL，按“2.2.2”项下制备供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液20μL注入液相色谱仪中，测定，计算加样回收率，结果木兰花碱的平均加样回收率为104.1%，RSD为1.0%。

2.9 样品测定

取不同批号的3批样品20g，研细，取1.0g，精密称定，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，精密吸取各批号供试品溶液20μL，分别注入液相色谱仪中，测定，结果见表2。

表2 三批样品中木兰花碱含量测定结果

3 讨论

研究发现许多免疫调节物质可作用于中枢系统而影响睡眠过程，在睡眠过程中免疫功能会出现规律性的变化，免疫调节物质在脑内的含量也随睡眠过程而发生变化。前期实验结果表明，枣仁安神颗粒连续灌胃7天能显著降低小鼠全脑IL-1β和TNF-α含量，但与有些报道[6]结果相反。控制炎症发生是否为枣仁安神颗粒改善睡眠作用的一个有效途径，值得探讨。因此，本研究选择了具有抗炎作用的木兰花碱作为该制剂的质量控制指标。

[1] 中华人民共和国卫生部. 部颁标准WS3-B-2164-96[S]. Z11-105.

[2] SCHULD A, HAACK M, HINZE-SELCH D, et al. Experimental studies on the interaction between sleep and the immune system in humans [J]. Psychother Psychosom Med Psychol, 2005, 55(1): 29-35.

[3] MULLINGTON J, KORTH C, HERMANN DM, et al. Dose-dependent effects of endotoxin on human sleep[J] . Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2000, 278(4) : 947-955.

[4] BAKER FC, SHAH S, STEWART D, et al. Interleukin 1β enhances non-rapid eye movement sleep and increases c-Fos protein expression in the median preoptic nucleus of the hypothalamus[J] . Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2005,288:998-1005.

[5] ESRA KÜPELI, MÜBERRA KOAR, ERDEM YEILADA,et al.A comparative study on the anti inflammatory, antinociceptive and antipyretic effects of isoquinoline alkaloids from the roots of Turkish Berberis species[J]. Life Sci 2002, 72(6): 645-657.

[6] LYNN CHURCHILLA,PING TAISHIA,MINGFEI WANG,et al. Brain distribution of cytokine mRNA induced by systemic administration of interleukin-1β or tumor necrosis factor α [J]. Brain Res，2006, 1120(1): 64-73.

(责任编辑：魏 晓)

Determination of Magnoflorine in Zaoren-anshen Granule by HPLC

Zhang Ying，Jiang Hong,You Xianmin*

(Liaoning Academy of Chinese Medicine,Shenyang 110034，China)

Objective:To establish the determination method of the concent of magnoflorine in Zaoren-anshen granule by HPLC.Methods:The column was Ultimate XB-C18(5μm，4.6mm×250mm), the detection wavelength was at 278 nm, the mobile phase was the mixture of acetonitrile-0.2% phosphoric acid-0.2% triethylamine. The gradient elution was carried out with a flow rate of 1.0mL·min-1．Results:A good linear correlation of magnoflorine was observed, r=1, the average recovery was 104.1% with RSD of 1.0%. Conclusion:The method can be used as the quality control method of this preparation.

Zaoren-anshen Granule; Magnoflorine; HPLC

2014-08-25

辽宁省科技厅博士启动基金项目(20121099)

张颖(1979-)，女，辽宁省中医药研究院副研究员，研究方向为中药药效物质基础及质量评价。

尤献民(1964-)，男，辽宁省中医药研究院研究员，研究方向为中药新药开发。

R284.2

A

1673-2197(2015)01-0025-03

10.11954/ytctyy.201501013