东北虎圈养环境土壤中蛔虫虫卵的分离与鉴定

张长生　彭智伟　史沁欣　郝春晓　侯志军

摘要 [目的] 对东北虎圈养环境土壤中蛔虫虫卵进行分离与鉴定。[方法]对黑龙江某虎园内的土壤进行随机采样，对蛔虫虫卵进行分离，通过形态学鉴定、分子生物学鉴定和分子进化树对其进行鉴定。[结果] 通过形态学鉴定确定土壤中含有2种形态的虫卵。分子生物学鉴定结果表明该虫卵分别是是狮弓蛔虫虫卵和猫弓首蛔虫虫卵。分子进化树分析结果表明狮弓蛔虫属于弓蛔属，猫弓首蛔虫属于弓首属。[结论]通过形态学观察、分子鉴定和进化树分析确定土壤中含有狮弓蛔虫虫卵和猫弓首蛔虫虫卵。

关键词 东北虎；土壤；狮弓蛔虫；猫弓首蛔虫；分子生物学鉴定

中图分类号 S85 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）11-127-02

蛔虫病的流行极广[1]，猫科动物蛔虫病的病原体有弓首科弓首属的猫弓首蛔虫（Toxocara cati）和蛔科弓蛔属的狮弓蛔虫（Toxascaris leonina）。猫弓首蛔虫是猫科动物常见的寄生虫病。据调查猫弓首蛔虫在猫科动物中感染率很高，为25.2%～66.2%[2]。蛔虫病可导致动物营养不良、贫血、精神沉郁和生长发育受阻，幼小动物甚至死亡[3-5]。蛔虫的发育主要分为虫卵、幼虫和成虫。感染期是在虫卵和幼虫的阶段。经过4次蜕皮后进入到成虫期，蜕皮是蛔虫发育过程中最显著的特征之一。蛔虫在幼虫期是无增殖的。虫卵是在外界土壤中发育的，而虫体是在生物体内寄生[6-8]。笔者对散养园内的土壤进行随机采样分析，通过形态学鉴定可判断土壤中含有2种形态的虫卵，通过分子生物学鉴定确定该虫卵分别是狮弓蛔虫虫卵和猫弓首蛔虫虫卵，最后构建进化树确定其分类地位。

1 材料与方法

1.1 样品材料 土壤来自于黑龙江某虎园。

1.2 试剂 饱和硝酸盐溶液、5%氢氧化钠溶液、蛋白酶K、组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒（原平皓生物技术有限公司）产品、rTaq酶、DNA Maker DL2000T（宝生物工程有限公司）产品；DNA胶回收试剂盒，为OMEGA公司产品。

1.3 镜检方法 采用饱和硝酸钠漂浮法检查土壤中蛔虫卵[9]。

1.4 虫卵DNA的提取 将保存的虫卵液用研磨器研磨10 min后，加入20 μl蛋白酶K 37 ℃水浴过夜。使用组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，-20 ℃下保存。

1.5 PCR引物设计 根据GenBank上猫弓首蛔虫ITS-I序列随即设计1对特异性引物，上游引物：5-GTGTTGAGGGGAAATGGGTGAC- 3，下游引物：5-CAATGTGCGTTCGAAATGTTAG -3，长度大约为414 bp。根据保守引物NC5/NC2对狮弓蛔虫的整个ITS序列进行扩增，上游引物NC5：5-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3； 下游引物NC2：5-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3。目的片段长度约为867 bp。

1.6 PCR反应 采用25 μl PCR体系：10×PCR Buffer 2.5 μl、MgCl2 2 μl、dNTP 2.5 μl、上下游引物各1 μl、双蒸水12 μl、Taq酶1 μl、模版3 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性，5 min； 94 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃延伸10 min，32个循环。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳下进行观察。

1.7 扩增片段的克隆及筛选使用DNA胶回收试剂盒对扩增片段进行纯化，纯化后产物连接到pMD18-T载体上，将连接产物转化至感受态细胞中，振荡培养后涂布在含Amp的LB上，过夜培养后挑选白色的单菌落，对菌落进行PCR鉴定，筛选阳性克隆并进行测序。

2 结果与分析

2.1 蛔虫虫卵的形态结构 在显微镜下观察，狮弓蛔虫虫卵呈椭圆形，外有1层光滑的壳，呈黄褐色，大小为82.59 μm×64.54 μm。猫弓首蛔虫虫卵呈的虫卵呈亚球形，卵壳凹凸不平，大小为66.18 μm×76.40 μm（图1）。

2.2 PCR扩增结果 用保守引物NC5/NC2对狮弓蛔虫进行扩增，得到857 bp大小的片段（图2）。特异性引物对猫弓首蛔虫进行扩增，得到416 bp大小的片段（图3）。

2.3 狮弓蛔虫和猫弓首蛔虫的ITS-I序列比较结果使用MEG4.1生物软件对狮弓蛔虫和猫弓首蛔虫的基因序列与GenBank数据库上的其他蛔虫的ITS-I序列建立系统进化树分析，包括寄生在人和猪小肠内的蛔虫（Ascaris）； 寄生在猫、狗、狐、狼、狮等食肉动物体内的弓蛔虫（Toxocara）； 寄生在鸡等家禽的禽蛔虫（Ascaridia）； 寄生驴、马的副蛔虫

（Parascaris）； 寄生在蛙、蛇等两栖、爬行动物的蛇蛔虫（Ophidascaris）。遗传进化树分析结果表明，15种蛔虫的ITS-1基因可大致分为2组。该试验的狮弓蛔虫属于弓蛔属，猫弓首蛔虫属于弓首属。其中，猫弓首蛔虫与马来西亚弓首蛔虫的亲缘关系较近，同源性为98.3%；狮弓蛔虫与猫弓首蛔虫的同源性为80.5%（图4）。

3 讨论

蛔虫生活史简单，雌虫产卵量大，虫卵对外界环境的抵抗力强，如果用未经处理的粪便施肥，粪便中的蛔虫卵可能会广泛污染土壤和周围环境[10]。笔者对虎园散养圈内所采的10份土样进行虫卵形态学观察，在其中1份中发现蛔虫虫卵，从形态学上初步鉴定为狮弓蛔虫和猫弓首蛔虫，同时又用分子方法进一步证明确定所观察到的蛔虫虫卵为狮弓蛔虫和猫弓首蛔虫，所得序列与GenBank已知的其他蛔虫的序列进行比较发现，狮弓蛔虫属于弓蛔属，猫弓首蛔虫属于弓首属，随机采取的土样中蛔虫虫卵已经不能用麦克马斯特法测定其EPG值，仅能通过饱和硝酸钠漂浮法检测是否为阳性，说明土壤中蛔虫卵的数量较少。

蛔虫的感染会对东北虎的健康造成很大的影响，但在现有的条件下很难将东北虎蛔虫病根治，只能将其感染率及感染强度降到最低。每次在群投驱虫时，要更换不同的驱虫药，避免蛔虫产生耐药性，从而导致驱虫药失效。圈养东北虎要与散养东北虎隔绝开来，避免交叉感染。发现严重食欲不振、消瘦的东北虎时应特别注意，必要时要单独进行驱虫。建议对园内的动物进行定期驱虫，尤其是对象东北虎等感染较为严重的动物，可根据实际情况定期采集新鲜粪便送往实验室检查，根据感染程度制定相应的驱虫措施，以防止蛔虫病的爆发[11]。

该研究结果不仅为研究狮弓蛔虫和猫弓首蛔虫的分子鉴定和系统发生等奠定了基础，而且亦为研究蛔虫病是否与动物采食被感染性虫卵污染的土壤、饲料和水提供理论借鉴。

参考文献

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[10] 李雍龙.人体寄生虫学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2009：164.

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责任编辑 陈玉敏 责任校对 李岩