不同甜瓜品种再生体系的比较研究

付秋实 谭明明 王烨 王怀松

摘要：以不同基冈型的甜瓜品种为材料，研究了不同激素组合，AgNO3质量浓度以及基因型对甜瓜再生的影响。结果表明，不定芽诱导中最适宜的激素组合为MS+1.0mg-Lˉ6-BA+0.5mg-LˉABA（脱落酸），在此培养基上薄皮甜瓜‘IVF501和‘IVF509的不定芽诱导率分别为88.00%、79.60%，厚皮甜瓜‘IVF525和‘IVF604的不定芽诱导率分别为76.50%、74.75%。不同质量浓度的AgNO3对甜瓜不定芽分化的影响有差异，1.0mg·Lˉ1AgNO3有抑制愈伤组织分化的作用，能有效减少玻璃化的发生，当质量浓度为2.0mg-Lˉ1时，虽然明显地抑制了愈伤组织分化，但同时降低了不定芽分化率。溥皮甜瓜‘IV F'501与厚皮甜瓜‘IVF525具有较高的不定芽诱导率，将诱导的不定芽转入伸长培养基中（MS+6-BA0.05mg-Lˉ1），分化的不定芽能够伸长长大，在生根培养基中（MS+IAA0.4mg·Lˉ3容易生根。薄皮甜瓜获得完整再生植株需50—60d，厚皮甜瓜获得完整再生植株需60—75d。

关键词：甜瓜；离体再生；脱落酸（ABA）；硝酸银（AgNO3）

甜瓜（Cucumis melo L.）是世界重要的经济作物。植物组织培养技术是植物细胞工程和基因工程的关键技术之一。甜瓜高效再生体系的建立是遗传转化的基础。在甜瓜组织培养方面，日前已有通过真叶、子叶、下胚轴等多种外植体再牛完整植株的报道。

添加ABA（脱落酸）是多种难以再生植物组织培养的有效措施。前人以子叶作外植体，6-BA为主要诱导激素，辅之以ABA，通过器官直接发生途径，建立了不同基因型黄瓜子叶的再牛体系。李泠等报道，ABA在黄瓜再生中起到了重要的作川，与激动素相配合能促进植株分化，并能抑制异常胚状体形成，促进正常胚状体的发生。AgNO3（硝酸银）是乙烯活性抑制剂，Bleecker&Kende认为，AgNO3是以竞争性作用于乙烯作用部位而促进器官和体细胞胚胎发生，其作用主要表现为抑制愈伤组织形成，增加外植体产生不定芽的数量及提高植株再生频率。周音等研究表明，加入2.0mg-Lˉ1AgNO3还可有效防止生菜玻璃苗的产生。这在其他植物离体培养中也已得到证实。但是关于ABA以及AgNO3对甜瓜再生影响的研究鲜有报道，并且再生潜力也依基因型不同而明显不同。我国有丰富的甜瓜种质资源，本试验以不同基因型的甜瓜品种为材料，对影响再生的主要因素进行探讨，以期为瓜类作物快速繁殖、种质资源保存和创新等提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1材料

供试材料为薄皮甜瓜‘IVF501与‘IVF509，厚皮甜瓜‘IVF525与‘IVF604，均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所甜瓜课题组选育。

1.2方法

1.2.1 无菌苗的获得选取饱满种子，用无菌水浸泡5—6 h，然后将甜瓜种子去壳，经70%乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗2～3次，再用2%（w）NaCl0灭菌15min，无菌水冲洗3—5遍次，用无菌滤纸吸干，平放接种于不加生长调节剂的MS培养基上，置于温度为26℃、光强30～40μmol·mˉ2sˉ1、每天光照时间14h的培养室中培养，3～7d后，子叶开始变绿，胚根伸长，获得无菌苗。基本培养基为MS培养基，蔗糖30g-Lˉ1，琼脂7g·Lˉ1，pH5.8。

1.2.2 激素质量浓度筛选 甜瓜品种选用‘IVF501，激素选用6-BA与ABA。待无菌苗子叶刚刚转绿时，从距离胚轴约2mm处剪下2片子叶，再横切为两部分，取近胚轴半片做外植体，叶背向培养基，叶面向上，分别接种于6-BA（1.0、1.5、2.0mg·Lˉ1）与ABA（O、0.5、1.0 mg·Lˉ1）不同质量浓度组合的培养基中，共9个处理，每皿接种9—11块外植体，每个处理20皿，30d后统计愈伤组织诱导率与不定芽诱导率.

愈伤组织诱导率/%=愈伤组织数量/外植体总数量×100：

不定芽诱导率/%=诱导出芽的外植体数量/外植体总数量×100。

1.2.3不同品种对不定芽诱导率与分化率的影响甜瓜品种选用‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604。根据1.2.2的试验结果，选出不定芽诱导与分化率较高的激素组合，将4个不同品种的子叶外植体接种于此培养基上，共4个处理，每皿接种9—11块外植体，每个处理20皿，30d后统计愈伤组织诱导率与不定芽诱导率。

1.2.4添加AgNO3对不定芽诱导与分化的影响甜瓜品种选用‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604。在MS+1.0mg.L-16-BA+0.5mg.L-1ABA培养中，添加0、1.0、2.0mg·Lˉ1AgNO3，共12个处理，每皿接种8～10块外植体，每个处理6皿，30d统计愈伤诱导率与不定芽诱导率。

1.2.5 不定芽伸长 由试验筛选出再生率较高的1个薄皮甜瓜品种‘IVF501与1个厚皮甜瓜品种‘IVF525。将在诱导培养基上分化出不定芽的外植体切成小块，转至MS+0.05 mg -Lˉ16-BA的不定芽伸长培养基上，1周后切下单芽，继代1次，15d观察有效苗的获得情况。

1，2.6生根甜瓜材料选用‘IVF501与‘IVF525，激素选用IAA。当芽长伸长至2—3cm时，选取健壮整齐的无根苗，用解剖刀白基部切下，转至MS+0.4mg-Lˉ1LAA的生根培养基中，15d观察获得有效生根苗的情况。

2结果与分析

2.1激素质量浓度筛选

由表1可以看出，对于甜瓜品种‘IVF501，不定芽的诱导和分化与6-BA和ABA两种激素配比密切相关，较低质量浓度的ABA与适宜质量浓度的6-BA配比，有较高的芽分化率。6-BA是甜瓜子叶分化的必需生长调节物质，当6-BA质量浓度为1.0 mg·Lˉ1时，不定芽的诱导率最高，随着6-BA质量浓度的升高，疏松愈伤组织分化加快，当6-BA质量的浓度为2.0mg-Lˉ1时，芽成簇生状，不利于单个芽的继续分化。低质量浓度ABA对不定芽诱导与分化有促进作用，高质量浓度时则有抑制作用，当6-BA质量浓度为1.0mg·Lˉ1时，0.5mg·Lˉ1ABA较小添加ABA不定芽诱导率提高12.5%。MS+1.0nlg·L-16-BA+0.5mg·Lˉ1ABA的芽分化率最高为89.OO%、

2.2不同品种对不定芽诱导率与分化的影响

由表2可以看出，在MS+1.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1ABA培养基中，不同甜瓜品种的不定芽诱导与分化率不同，‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604的不定芽诱导率分别为88.OO%、79.60%，、76.50%、74.75%，愈伤组织诱导率分别为43.00%、46.27%、50.50%、54.55%。薄皮甜瓜‘IVF501、‘IVF509的不定芽诱导率明显高于厚皮甜瓜‘IVF525、‘IVF604，但愈伤组织诱导率低于厚皮甜瓜.薄皮甜瓜‘IVF501与厚皮甜瓜‘IVF525具有较高的不定芽诱导率。

2.3 AgNO3对不定芽诱导与分化的影响

由表3可以看出，在MS+1.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1ABA培养基中，添加1.0mg·L-1AgNO3有抑制愈伤组织分化的作用，减少了玻璃化的发生 当质量浓度为2.0mg·L-1时，虽明显的抑制了愈伤组织分化，但同时降低了不定芽分化率，并且玻璃化现象严重。当AgNO3质量浓度为1.0mg·L-1时，‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604的不定芽诱导率分别为76.27%、68.96%、63.46%、22.22%。因此1.0mg·L-1AgNO3对不定芽诱导与分化较适宜。

2.4不定芽伸长与生根

如图l所示，将外植体上的丛生或单芽切下，接种到MS+0.05mg·L-16-BA培养基上继续培养，丛生芽现在培养基伸长1周，再切下单芽，继代培养，继续伸长，15d左右，不定芽伸长2—3cm待无根苗长到2～3cm时，白基部切下，转接到MS+0.4mg·L-1IAA培养基上，诱导生根。生根效果好。薄皮甜瓜获得完整再生植株需50—60d，厚皮甜瓜获得完整再生植株需60～75d。

图l 不定芽伸长与生根

（A）5VF501不定芽伸长；（B）‘IVF525小定芽伸长；（C）‘VF501在生根培养基中生根；（D）‘IVF525在生根培养基中牛根。

3 讨论与结论

植物离体组织培养中，不定芽再生频率与植物基因型、外植体类型及生长调节剂配比等因素有关。6-BA是甜瓜再生分化的关键物质本试验rft不定芽诱导最适6-BA质量浓度为1.0mg·L-1。在诱导不定芽的增殖生长中，加入较高质量浓度的6-BA，虽然对芽的分化有促进作用，但是容易产生丛芽，这与孙天国等的研究结果一致。因此在继代过程中适当降低细胞分裂素质量浓度对芽的正常生长是有利的。

本试验中ABA对甜瓜子叶的芽分化有促进作用，6-BA和ABA的不同配比影响甜瓜子叶不定芽的分化，不定芽诱导中最适宜的激素组合为MS+ABA0.5mg·L-1+6-BAl.0mg·L-1，在此培养基上能正常分化的不定芽较多并明显伸长，不定芽的生长较快（表2，图1）。添加ABA是多种难以再生卡植物组织培养的有效措施，应用到黄瓜组培上也获得相似的结果。梅茜和张兴国研究表明，在培养基中添加ABA可明显提高黄瓜的芽再生能力，且以1.0mg· L-1为最适宜，如果不添加ABA，则很难产生不定芽.Sekioka等的研究表明在黄瓜的组织培养中，低质量浓度的ABA（O.1mg·L-1）促进胚状体的正常发育，而高质量浓度的ABA（ 1.0mg·L-1）能显著减少培养物的愈伤组织，并控制胚状体处于球形胚或球形胚后期，这与王秀红等的研究结果一致。

本试验中不同浓度的AgNO3对甜瓜不定芽分化的影响有差异，1.0mg·L-1AgNO3有抑制愈伤组织分化的作用，能有效的减少玻璃化的发生，当质量浓度为2.0mg·L-1时，虽明显地抑制了愈伤组织分化，但同时降低了不定芽分化率，并且玻璃化现象严重，这与前人的研究结果一致。AgNO3对植物形态发生具有促进作用，但其作用机理尚不十分清楚。可能的原因是植物组织和细胞在离体培养时易产生乙烯并逐渐积累，乙烯积累可使培养物生长分化受到影响或毒害。Kevers等研究认为玻璃苗的产生与培养容器中的乙烯变化有明显关系，玻璃化组织的外植体将ACC转化为乙烯的能力也比对照高。Ag+是一种较好的乙烯活性抑制剂，培养基中添加AgNO，能有效抑制乙烯形成，减少或消除乙烯对细胞生长的不利影响。有的学者认为AgNO3是竞争性地作用于乙烯作用部位而促进器官发生，提高细胞的再生能力的。

不同甜瓜品种的不定芽诱导与分化率不同，‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604的不定芽诱导率分别为88.00%、79.60%、76.50%、74.75%（表2）薄皮甜瓜‘IVF501、‘IVF509的诱导率明显高于厚皮甜瓜‘IVF525、‘IVF604，说明薄皮甜瓜冉生能力强于厚皮甜瓜。因此基因型对这种再生能力的获得可能有决定性的影响。只有进行大量的试验才能筛选出具有较好培养效果的基因型二本试验中将诱导的不定芽转入伸长培养基中（MS+6-BA0.05mg·L-1），分化的不定芽能够伸长长大，在生根培养基中（MS+IAA0.4mg·L-l）容易生根 薄皮甜瓜获得完整再生植株需50～60d，厚皮甜瓜获得完整再生植株需60～75d。