Ang1一Akt途径对大鼠体外血一脊髓屏障功能的调节

刘欣春 李杰 裴磊 王森 彭云飞

摘 要：检测血管生成素1（angiopoietml，Angl）对体外培养脊髓微血管内皮细胞（spinal cord nucrovascular en-dothelial cell，SCMEC）屏障功能的调节机制。体外分离培养大鼠SCMEC及胶质细胞，通过双室培养系统建立体外血一脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）模型；分别用Angl及Angl+wortmannin（Akt抑制剂）处理培养细胞，Western-blot检测Akt及连接蛋白质的表达：放射自显影检测Akt激酶活性变化：测定跨内皮电阻（TEER）反映各组细胞屏障功能；细胞免疫荧光检测连接蛋白在细胞接触面的分布变化；免疫共沉淀实验分析连接蛋白之间的相互作用改变。结果显示，Angl处理组细胞Akt活性及TEER值均有明显升高，Angl处理后ZO-1及VE-cadherin在细胞连接处的分布增强，occludin/ZO-l、VE-cadherin/p-catenin之间的相互作用均较对照组显著增强，且以上Angl处理所引起的SCMEC功能改变均可被wortmannin所拮抗。表明Angl通过Akt活性调节SCMEC连接蛋白的分布及相互作用，从而影响体外BSCB的屏障功能。

关键词：血一脊髓屏障；血管生成素l（ Angl）；Akt

中图分类号：R33 8.2+1 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）03-0218-06 脊椎动物的血一脊髓屏障（ blood-spinal cordbamer，BSCB）是血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的延伸，是中枢神经系统特有的屏障结构。BSCB由脊髓微血管内皮细胞（spinal cord mi-crovascular endothelial cell，SCMEC）间的紧密连接及星形胶质细胞周足构成，可有效地阻止血液中的大分子进入脊髓实质，为中枢神经系统提供稳定的微环境[I]。现有研究表明，多种脊髓病变与BSCB屏障功能异常有关，如创伤性脊髓损伤[2，3]、放射性损伤[4] 、肌萎缩性脊髓侧索硬化症[5，6] 、感染[7J等。内皮细胞间的连接蛋白及细胞骨架是构成内皮细胞屏障的主要分子基础，其表达量、分布及相互作用的改变是导致内皮细胞通透性增高的直接原因[8] 。

血管生成素（ angiopoietin，Angl）是一种有效的血管生成因子，参与血管生成的各个阶段，许多其他血管生成因子可通过Angl诱导新血管的生成。在血脑屏障，Angl作用于Tie-2酪氨酸激酶受体，参与维持屏障完整性及血管稳定[9，10]；近期有研究报道，Angl可通过上调紧密连接蛋白ZO-2（zonula occludens-2）稳定脑微血管内皮细胞哦在非中枢神经系统微血管内皮细胞，Angl可通过PI3 K/Akt途径发挥抗凋亡[12]及维持血管稳定性的作用[l3]。本研究以分离培养的大鼠SCMEC为研究对象，在体外建立BSCB模型，探讨Angl-Akt途径对血脊髓屏障的通透性影响并初步分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

成熟Sprague-Dawley大鼠（275～300 g）由中国医科大学实验动物部提供。DMEM/F12培养基为Sigma公司（美国）产品；碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素l（Angl）购自Peprotech公司（美国）；Wort-mannln购自Gene Operation（中国）；蛋白G琼脂糖购自Pierce公司（美国）；PKA抑制肽购自Merck Millipore公司（德国）；组蛋白H2B为EnzoLife Sciences公司（瑞士）产品；y-32PlATP购自北京福瑞生物科技有限公司（中国）；兔IgG、兔抗大鼠occludin、ZO—1、卢-catenin抗体、驴抗兔IgG（ FITC）、Prolong Gold Antifade封片剂购自Invit-rogen公司（美国）；山羊抗大鼠Aktl、p-actin、兔抗大鼠pAk[抗体、牛抗山羊IgG（ HRP）、牛抗兔IgG（HRP）购自Santa Cruz公司（美国）；兔抗大鼠VE-cadherin购自Abcam公司（美国）；DC蛋白定量试剂盒购自Bio-Rad公司（美国）；增强型化学发光试剂盒购自Pierce公司（美国）；其他常规试剂为Sigma公司（美国）产品。

1.2主要仪器设备

Millicell～ ERS-2细胞电阻仪；MiⅡipore Milli-cell插入式细胞培养皿；Beckman液闪计数仪；Bio-Rad电泳仪及电泳槽；Eppendorf台式低温离心机；苏净VS-1300U超净台；Thermo ScientificSeries8000 C02细胞培养箱；Olympus BX51荧光显微镜。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠脊髓微血管内皮细胞（SCMEC）的分离培养

按本实验室常规方法分离培养大鼠SCMEC。成熟SD大鼠C02窒息处死，手术分离椎管后注射冷D-Hanks液以分离脊髓组织，去除脑脊膜及大血管。冷DMEM/F12培养液中剪碎组织至1 mm3大小，冰上匀浆后于37 °C水浴胶原酶Ⅱ消化30 min。消化产物200 g离心5 min，220/o BSA重悬组织沉淀，2 000 g离心10 min，弃上层髓磷脂成分，DMEM/F12清洗下层血管组织。无菌滤器（BD Falcon，295 lim及40 μm）依次过滤以进一步去除大血管及血细胞，收集微血管组分。0.1%胶原酶及脂肪酶于37 0C消化脊髓微血管30 min.间歇搅拌并镜下观察，待内皮细胞出芽呈串珠样时1000xg离心5 min终止消化。SCMEC培养液（DMEM/F12、1 0%胎牛血清、10%马血清、2 mmol/L谷氨酸钠、l g/L肝素、1μg/L bFGF、10 μg/L VEGF、50 mg/L庆大霉素、3p，mol/L嘌呤霉素）重悬消化后的微血管组分，接种于预铺IV型胶原及纤连蛋白（均为5 μg/cm2）的培养平板，接种密度为lx1 04/cm2。培养6d待细胞融合成单层后常规免疫荧光观察因子Ⅷ表达情况，确定SCMEC分离培养纯度> 95%。

0.125 010胰酶（含0.020/0 EDTA）消化SCMEC，按不同密度进行传代：1）1：1接种于6孔培养板，用于蛋白样品制备；2）1：5接种于6孔培养板（内预置盖玻片），用于细胞免疫荧光；3）1：1接种于Millicell插入小室，置于24孑L板（预铺胶质细胞）中，用于跨内皮电阻（TEER）测定。所有培养细胞于37℃50/0 C02培养箱中培养7d，每2—3 d更换培养液。

1.3.2血管生成素1（Angl）处理培养细胞

为检测Angl对体外SCMEC屏障功能的影响，于培养第7d用Angl （0.1 mg/L）或Angl（ 100 mg/L） +Wortmannin（0.1 μmol/L）处理细胞12 h，于不同时间点（0、4、8、12 h）测量Angl处理后跨内皮电阻变化，并收集SCMEC进行激酶活性测定及免疫印迹等检测。

1.3.3 Akt激酶活性测定

通过测定Akt底物蛋白H2B的磷酸化状态反映Akt激酶活性，具体如下：收集SCMFC制备蛋白裂解液，蛋白G琼脂糖4℃预孵育30 min后加入抗Akt抗体免疫沉淀2h，离心后依次用裂解液、纯水及激酶反应液（50 mmol/L HEPES、10 mmol/l_ MrlCl2、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L二硫苏糖醇、1μmol/L PKA抑制剂，pH 7.2）清洗沉淀。在反应液中加入20 μCi/mL[γ-32P]ATP及0.2g/L组蛋白H2B，30 °C孵育10 min。取25 μL反应液滴于Whatman p81阳离子交换滤纸，5%磷酸溶液终止反应，充分清洗后放人含10 mL蒸馏水的液闪瓶内，Beckman液闪计数仪测定cpm值。

此外，本研究亦采用放射自显影检测Akt激酶活性，即在上述激酶反应液中加入50μCi/mL[γ-32P]ATP及组蛋白底物，30 0C孵育30 min后用SDS样品缓冲液终止反应，SDS-PAGE分离蛋白成分后放射自显影观察H2B的磷酸化状态。1.3.4跨内皮电阻（TEER）测定

使用Millicell⑩ERS-2细胞电阻仪测量双室培养系统中SCMEC跨内皮电阻值，以反映其内皮屏障功能及通透性。在Angl处理后不同时间点（每个时间点设置3个平行孔），将正负电极分别置于培养内室及外室，记录待测孔电阻值（Ru），按公式TEER=（Ru-Rc）xS计算各组TEER值（ Ω·cm2），其中Rc为未接种细胞空白孔电阻值，S为培养面积。

1.3.5免疫印迹及免疫共沉淀

收集各组SCMEC，Nonidet P-40裂解液（ 50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EG-TA，lO% glycerol.l% Nonidet P-40.2 mmol/L PMSF，1 mmol/L Na3V04，1μg/mL亮肽素，1 mg/L抑肽酶，pH 7.4）处理后提取总蛋白，BCA定量法测定蛋白浓度后制备蛋白样品。每组按30 μg上样量进行SDS-PAGE电泳分离蛋白成分，转印至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭，依次经一抗、二抗孵育后进行ECL显色（p-actin做为内参照）。

免疫共沉淀实验中每组取400卜Lg蛋白裂解液，用2 yg兔IgG进行预处理，加入蛋白A琼脂糖珠离心后，取上清加入2 μg IP抗体（ZO-1或VE -cadherin，另设无IP抗体IgG对照），室温于旋转混匀过夜，加入蛋白A琼脂糖珠沉淀抗原抗体复合物，离心后用上样缓冲液处理琼脂糖珠，煮沸变性，SDS-PACE分离蛋白后按上述方法进行免疫印迹分析（抗occludin或抗p-catenin抗体）。

1.3.6 细胞免疫荧光

40/0多聚甲醛固定经Angl处理12 h后的SCMEC，0.1% Triton-100通透，S%牛血清白蛋白封闭，依次经抗ZO—1或VF -cadherin抗体及FITC标记IgG孵育后，Prolong Gold Antifade封片剂（含DAPI）封片，于Olympus BX51荧光显微镜下观察结果。

1.3.7统计学分析

本研究中TEER、免疫印迹、放射自显影等实验结果均采用GB-STAT软件（Dynamic Microsys-tems）进行双因素方差分析及Dunnett's检验，P<0.05为差异显著，P

2结果

2.1 Angl处理增强体外培养SCMEC中Akt激酶活性

体外分离大鼠脊髓微血管内皮细胞（SCMEC），建立体外血一脊髓屏障。由于在培养的内皮细胞系中Angl可通过Akt-PI3K途径影响内皮细胞活力及血管生成过程[1]，在本研究中我们首先检测了Angl对SCMEC中Akt活性的影响。分别用Angl、Angl+Wortmannin（ WM，PI3K/Akt途径抑制剂）处理传代培养第7d的SCMEC单层，预处理后Oh、4h、8h、12 h收集各组细胞。免疫印迹结果显示，Angl处理4h后，Aktl磷酸化水平与对照组相比有明显升高，Wortmannin则可抑制Angl引起的Aktl磷酸化（图1A、C）；以组蛋白H2B为底物，放射自显影（图1B）及液闪计数（图1D）均显示Angl处理后，Akt活性有显著增高。该结果说明，Angl在本研究分离培养的SCMEC中可以活化Akt，且该作用可被Wortmannin所抑制。

2.2 Angl通过影响Akt活性增强体外培养SCMEC屏障功能

为确定Angl-Akt通路对BSCB屏障功能的影响，在Angl处理双室培养的SCMEC后不同时间点测定跨内皮电阻（ TEER）。结果显示，Angl处理后4h，SCMEC单层上皮TEER值与对照组相比明显升高，即Angl可增强体外培养SCMEC屏障功能；此外，该效应可被Wortmannin所拮抗，即与Angl处理组相比，Angl+WM组TEER值有所下降（图2）。该结果表明，Angl可能通过影响Akt.活性增强体外培养SCMEC屏障功能。

2.3 Angl-Akt通路影响连接蛋白在SCMEC细胞连接处的分布

为进一步明确Angl-Akt途径影响SCMEC屏障功能的机制，我们检测了几种细胞连接蛋白（occluclin、ZO-1、VE -cadherin、β-catenin等）经Angl处理后在细胞连接处的分布变化。为更清晰地观察细胞接触面，我们在细胞免疫荧光试验中采用1：5比例进行传代培养，在该培养条件下，SCMEC大多（>600/0）呈现多角形。结果表明，紧密连接蛋白ZO-1及粘着连接蛋白VE-cadherin在Angl处理后在细胞连接处的分布显著增强，而Angl+WM组则无此改变（图3），提示Angl可通过Akt活性影响连接蛋白在细胞表面的分布，从而增强SCMEC的屏障功能。

2.4 Angl-Akt通路影响SCMEC连接蛋白间的相互作用

在观察到Angl对ZO一1及VE -cadherin在细胞连接处的分布影响后，我们进一步通过免疫共沉淀检测了细胞连接蛋白间的相互作用改变。在Angl处理12 h后，收集SCMEC裂解液，统计分析Co -IP结果显示，Angl可以增强occludin/ZO-1及VE—cadherin/β-catenin之间的相互作用分别达200%及150%以上，而Angl+WM组与Angl处理组相比则抑制了连接蛋白间的相互作用，表明Angl-Akt途径可通过促进细胞连接复合体的形成提高SCMEC的内皮屏障功能（图4）。

3讨论

脊髓微血管内皮细胞（SCMEC）在构成血脊髓屏障（BSCB）中的功能与脑微血管内皮细胞（BMEC）构成血脑屏障（BBB）中的作用类似，近年来在血中枢神经系统屏障的研究中建立了许多成功模拟BBB或BSCB的体外模型[1416]。本研究通过分离培养成熟SD大鼠脊髓微血管，在适当条件下消化培养SCMEC，经因子Ⅷ特异性抗体检测，SCMEC纯度可达95%[14，15]；在此基础上，于双室培养系统中共培养SCMEC和胶质细胞（已知后者可诱导中枢神经系统血脑屏障的形成[17]），通过每日测定TEER反映内皮屏障功能，发现在该培养条件下经6—7 d的培养，TEER值可达45—60Ω·cm2，表明成功建立体外BSCB模型。

Angl基因位于染色体8q22，由498个氨基酸组成，主要由周细胞及血管平滑肌细胞表达，作用于内皮特异性酪氨酸激酶受体Tie-2，其同源蛋白Ang2为其天然的竞争性拮抗剂。转基因研究证实，Angl基因缺失或Tie-2基因敲除的小鼠胚胎血管形成障碍、通透性增高且缺乏连续性从而不能形成血管网；而Angl过表达的转基因动物则表现为血管增生变粗且内皮细胞与周细胞的连接完整[18]。Angl在维持血管稳定性方面发挥重要作用，有报道称其中涉及Akt介导的抗凋亡效应[9，12]；此外，Angl可通过激活磷脂酰肌醇激酶（PI3K）引起柱蛋白（paxillin）磷酸化，加强内皮一基质间的相互作用，增加内皮管状结构的完整性。在本研究中，我们首先检测了Angl对体外培养的脊髓微血管内皮细胞Akt激酶活性的影响，即用Angl处理培养SCMEC后收集细胞裂解液，采用[32P]-掺入试验测定激酶活性，放射自显影及液闪计数结果均显示Angl处理后可引起SCMEC中的Akt活性增高。结合以往报道，该结果提示Angl对PI3K/Akt途径的调节作用在内皮细胞中是普遍存在的。在此基础上，我们又进一步检测了Angl对体外BSCB屏障功能的影响，TEER测定结果表明Angl处理4h后，SCMEC屏障功能显著增强，同时发现该作用可被PI3 K/Akt途径特异性抑制剂Wortmannin所拮抗，说明Angl可通过影响Akt活性调节BSCB功能，降低其通透性，维持BSCB的稳定。

在内皮屏障结构中，相邻内皮细胞间的细胞连接的形成及完整性对内皮通透性的维持至关重要。因此，我们检测了Angl处理后几种连接蛋白（ occludin、ZO—1、ZO -2、VE -cadherin、β-catenin）的表达情况，免疫印迹结果显示无明显改变，说明Angl不是通过影响连接蛋白的表达量调节BSCB的通透性。进一步通过免疫荧光技术发现，Angl处理后支架蛋白ZO-1与钙黏蛋白VE -cadherin在细胞接触面的分布明显增加；此外，紧密连接蛋白occludin与ZO-1，以及VE -cadherin与连环蛋白β-catenin之间的相互作用也在Angl处理后增强，且Angl所引起的效应均可被PI3K-Akt途径抑制剂Wortmannin所抑制。

综上结果表明，Angl可通过Akt改变连接蛋白在SCMEC细胞连接处的分布状态，并影响连接蛋白之间的直接作用，从而改变BSCB的通透性及屏障功能，该结论仍需进一步在体内研究中进行验证。此外，Angl还可通过其他途径参与维持血管稳定性及诱导新血管生成，如有研究表明Angl可促进胞浆素和金属基质蛋白酶一2（MMP-2）的分泌和基底膜的降解，从而促进内皮迁移和管状结构生成，还可通过降低血小板内皮细胞粘附分子（ PECAM）的磷酸化加强内皮间的连接，维持微血管壁的完整性[19]等等，这些信号转导分子在Angl调节BSCB屏障功能的过程中是否发挥作用仍需进一步的研究阐明。