转基因本直物对土壤微生物群落的影响及风险评价

关正君　鲁顺保　魏伟

转基因植物从1996年商业化以来，无论在发达国家还是在发展中国家，均呈现逐年增长的趋势。到2013年，全球转基因植物种植面积累计已达16亿公顷。与此相伴随，转基因植物对整个生态系统的影响及其潜在生态风险，也已受到社会各界高度重视。转基因植物对土壤生态系统，尤其对土壤微生物群落的影响，是对转基因植物投放市场之风险性评估的重要内容之一。就转基因植物而言，由外源基因表达引起植物生理代谢上的改变，以及外源基因的表达产物通过根系分泌等途径进入土壤生态系统，均会对根际土壤微生物群落发生潜在影响。开展转基因植物对土壤微生物影响的研究，对于科学评价转基因植物潜在的生态风险有重要意义。

可能的影响机制

转基因植物残留在土壤中的方式主要有外源基因和外源基因表达产物两种，与此相应，转基因植物影响土壤微生物群落的可能途径也主要有两种。

一种途径是，转基因植物的外源基因表达产物对土壤微生物及其群落的多样性产生一定影响，这种表达产物的主要成分为转基因植物残体所含的或根系直接分泌进土壤的外源蛋白质。研究表明。在转基因油菜的根际土壤微生物群落中，某些特征性脂肪酸含量显著提高，表明其微生物群落组成发生了变化。也有研究发现，转Bt（Bacillus thurigiens，苏云金杆菌毒蛋白）基因植物对根际土壤的菌根真菌产生明显影响。然而又有些研究发现，转基因植物对土壤微生物区系无显著影响。例如，大田种植的转Bt基因棉花与非转基因对照植株相比，其根系分泌物对土壤根际微生物没有显著影响。

另一种途径是，转基因植物的外源基因通过水平基因转移（horizontal gene transfer），就是通过将遗传物质传递给非子代的其他细胞的方式，整合到土壤微生物的基因组中，从而可能使土壤微生物的遗传特性与功能发生一定变化。例如，李（B.Lee）等人2010年对田间转基因西瓜进行风险评估时，发现其中的35S启动子基因存在向土壤微生物转移的可能。转基因抗虫棉中的nptlI基因可能向叶围细菌漂移。目前已在一种能与植株共生的黑曲霉微生物中发现原来存在于转基因油菜、黑芥菜、蒺藜和甜豌豆中的抗生素抗性基因。但是也有文献报道，转基因植物发生水平基因转移的频率低于自然转化的频率，因而转基因植物通过水平基因转移给人类和环境带来的风险可以忽略不计。

目前尚不明确。大量种植转基因植物对于土壤微生物产生何种影响，以及影响的机制如何。这方面的研究还不够系统。有待于运用新的技术和取得新的突破。

常用的研究方法

在评价转基因植物对土壤微生物的影响方面，目前国内外最常用的研究方法大致有四种，即传统培养法、微平板技术、现代生物标记技术和现代分子标记技术。

传统培养法传统的微生物培养方法是根据目标微生物选择相应的专性固体培养基，对可培养的微生物进行分离培养，然后根据各种微生物的生理生化特征、外观形态及菌落形成单位来计测微生物的数量与种类。该法虽然简单且易于操作，但由于培养基和培养条件的限制，目前通过实验室人工培养方法分离、描述的微生物种类和数量，仅占估计数量的1%-5%，而其余95%-99%微生物种群仍未被分离。因此，传统培养方法只能作为一种辅助手段，并只有与其他先进技术相结合，才能较为客观而全面地反映土壤微生物群落结构的真实信息。

微平板技术美国Biolog公司开发的微平板技术是测定土壤微生物对95种不同碳源的利用能力。以及这些微生物的代谢差异，用以表征土壤微生物代谢功能多样性或结构多样性的方法。该方法由于操作简便，效率高，培养周期短，结果可重现，而成为研究土壤微生物多样性的主流方法之一。但由于培养环境如湿度、渗透压、pH等方面的改变都可能引起微生物对碳底物实际利用能力的改变，因此会造成一定误差。要想获得与大量微生物之群落代谢和功能多样性相关的信息，必须结合相关的分子生物学技术。

现代生物标记技术使用生物标志物（biomarker，指在某种效应过程中可测定的特异性生物分子）来描述土壤微生物的群落结构组成。是目前最常用的方法之一。磷脂脂肪酸（phospholipids fatty acid，PLFA）是微生物细胞膜的重要组成成分，不同种类微生物体内的PLFA组成及含量显示出极大的差异，所以PLFA可作为生物标志物，其种类及组成可用以描述微生物的群落结构。PLFA的谱图分析方法常用于研究复杂群落中微生物的多样性，表征在数量上占优势的土壤微生物群落，包括不可培养微生物。用该分析方法能直接提取原位土壤中微生物群落的脂肪酸，不需要对土壤微生物进行培养，因而可直接反映土壤微生物群落的原貌。其缺点在于只适合活的微生物，不同的微生物群落可能会产生重叠图谱。

现代分子生物学技术用于评价转基因植物对土壤微生物影响的现代分子生物学技术有许多种。这里列举若干。

一是基于核酸分子杂交技术的方法。核酸分子杂交技术是1970年代发展起来的一种新的分子生物学技术。在该类方法中，荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH；即以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法）是研究不可培养土壤微生物群落之多样性最为常用和有效的手段。FISH技术使直接显现土壤栖息地微生物成为可能，可用于对土壤样品中的微生物进行原位检测。

二是基于PCR技术的方法。该类方法中代表性的技术是变形梯度凝胶电泳（denaturant gradient gel electrophoresis，DGGE）和限制性片段长度多态性技术（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。

变形梯度凝胶电泳（DGGE）是根据PCR扩增的基因或基因片段核苷酸序列的不同，进行片段的分离。根据电泳条带的多寡和条带的位置，可以初步辨别出样品中微生物种类的多少，以分析土壤样品中微生物的多样性。由于DGGE具有可靠性强、重现性高、方便快捷等优点，在近十年内已成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具。

限制性片段长度多态性技术（RFLP）是利用限制性内切酶特性及电泳技术，对特定DNA片段的限制性内切酶产物进行分析，根据片段的大小及标记片段种类和数量的不同，评价微生物的群落结构和多样性。RFLP反映了DNA水平上的变异。该技术可以对大量土样进行分析，是研究微生物多样性的有效工具。末端限制性片段长度多态性技术（terminal restriction fragment length polymerphism，T-RFLP）是在RFLP基础上发展起来的新技术，相对于其他分子生物学技术具有分辨率高、易于实现自动化等特点，是分析复杂环境微生物群落的强有力工具之一。

三是宏基因组学（metagenomics）技术。宏基因组学也称为群落基因组学（community genomies），是指利用现代基因组技术直接研究自然状态环境中的微生物有机体群落，而不需要经过分离、培养单一种类的微生物。在土壤微生物多样性研究中，通过直接提取土壤样品的总DNA并进行限制性内切酶的酶切，获得大片段的DNA后直接与特定的载体连接，以构建克隆文库，然后对文库进行筛选或者直接进行高通量测序分析。如454测序技术，即根据焦磷酸测序法通过生物发光对DNA序列进行检测的技术；或Miseq测序技术，即以“边合成边”测序技术为基础，对数百万个DNA片段同时进行大规模平行测序的技术。

目前，基因测序技术及宏基因组分析技术是土壤微生物多样性研究的前沿。通过对基因组文库中的基因序列进行系统化研究，使土壤微生物的多样性分析趋于完整客观。应用免培养的新方法和新技术。可绕过微生物菌种分离培养这一技术难关，直接在基因水平上研究、开发和利用无法培养的微生物资源，有利于揭示不可培养微生物的基因多样性，为研究土壤微生物的复杂群落结构提供了重要工具。

综合应用上述涉及土壤微生物的研究技术，可深入研究诸多转基因植物对土壤微生物群落的影响，较全面地考察土壤微生物群落的组成信息，更有效地监测土壤微生物群落的时空变化，从而为转基因植物的土壤生物生态安全研究提供强有力支持。当然，由于转基因植物对土壤微生态系统影响的复杂性，目前的认识仍然极为有限，还存在诸多不一致甚至相互矛盾的研究结果。要想深入剖析转基因植物对土壤生态系统特别是对土壤微生物群落之结构与功能的影响，必须发展更先进的技术支撑系统，并需要在多种植物上进行大量的田间试验和长期的跟踪研究等。

研究的进展

众多研究报道显示，关于转基因植物对土壤微生物的安全性，存在着较大争议。多数研究认为，转基因植物仅对土壤微生物有轻微影响或者没有影响。只有少数研究发现，转基因植物会使土壤微生物群落的结构多样性发生显著变化。随着转基因作物种植时间的加长以及可能的生物富集作用的不断扩大，这种潜在的影响或风险有着不容忽视的高度不可预见性。下面列举有关几类转基因植物对土壤微生物影响的评价。

抗虫转基因植物对土壤微生物的影响

抗虫转基因植物所用的基因主要是苏云金杆菌毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂（proteinase inhibitors，PI）基因、外源凝集素（lectin）基因、淀粉酶抑制剂（aamylase inhibitor，aAI）基因、几丁质酶（chitinase）基因、核糖体失活蛋白（dbosome-inactivating-proteins，RIP）基因等。

目前国内外评估转基因植物对土壤微生物影响的研究，多以转Bt植物为材料。萨克西纳（D.Saxena）等人2002年在温室试验中发现，转CrylAb基因玉米（NK4640Bt）和非转基因玉米根际土壤中或添加玉米组织的土壤中可培养的细菌、放线菌和真菌数量无显著差异。2008年，巴拉昌达（D.Balachandar）等利用DNA指纹识别技术对转Bt棉花进行研究发现，转Bt和非转Bt棉花根际有益变形细菌多样性之间没有显著差异。2012年，宋亚娜等人利用PCR-DGGE和荧光定量PCR技术研究发现，一定时期内种植转crylAc/cpti双价抗虫基因水稻不会影响土壤氨氧化细菌的群落组成和丰度。然而在2009年，朱荷琴等人的研究认为，转豇豆胰蛋白酶抑制剂（CdTI）基因棉花对根际土壤中细菌、放线菌和真菌的数量有显著影响。2011年，甄志先等人研究了4年生转双抗虫基因741杨树试验林在生长季节中土壤微生物种群数量的变化。结果表明，转基因植株和非转基因植株之间在不同时期的根际和根表土壤细菌、放线菌和真菌数量存在一定差异，但未达到统计学显著的水平。

抗除草剂转基因植物对土壤微生物的影响

抗除草剂转基因植物所用的基因主要有抗草甘膦的EPSPS基因，抗草丁膦的PPT乙酰转移酶（Bar）基因、抗溴苯腈的腈水解酶基因等。

根据加拿大贸易与可持续发展国际中心（ICTSD）的一份有关遗传修饰作物（GMC）的调查报告显示，美国科学家已发现，在施用抗草甘膦除草剂系列的作物田中，由于大量使用草甘膦，有可能引起土壤微生物群落和植物健康状况的改变。邓菲尔德（K.E.Dunfield）和格米达（J.J.Germida）2001年对抗草甘膦油菜进行研究，发现转基因和非转基因油菜根际微生物群落存在显著差异。徐广惠等人2009年的研究发现，抗草甘膦转基因大豆降低了根际土壤细菌的数量和细菌群落的多样性，并对根际土壤中硝化螺旋菌属（Nitrospira）细菌（一类革兰氏阴性细菌）有一定的抑制作用。施马伦贝格尔（A.Schmalenberger）等人研究发现，转pat基因玉米（Zea mays）和甜菜（Betctvulgaris）与非转基因植株的根际细菌多样性之间无显著性差异。上述研究结果提示转基因植物对土壤微生物的影响可能与外源基因的种类有关。

抗病转基因植物对土壤微生物的影响

将编码抗菌蛋白质（如几丁质酶、葡聚糖酶、溶菌酶和防御素）的相关基因导人植物基因组中，可以对植物病原菌产生持久的广谱抗性，对抵御植物病害起到重要作用，但同时也可能对土壤微生物发生潜在影响。例如，导入外源水稻几丁质酶（RC24）的转基因水稻根内和根际的微生物群落会发生显著变化，转基因水稻根部内生真菌少于对照组，而内生细菌比对照组多10倍。表达抗菌肽的转基因马铃薯在开花期，能对芽孢杆菌种群结构和多样性产生短暂却显著的影响；但是在块茎形成期，转基因的和亲本的马铃薯具有类似的芽孢杆菌种群结构和多样性。此外，霍耶尔（H.Heuer）等人2002年利用PLFA、Biolog和PCR-DGGE技术，研究了表达T4溶菌酶转基因和非转基因马铃薯两种品系对土壤中细菌群落结构和变化动态的影响，结果发现转T4溶菌酶基因植物的根际土壤细菌群落变化是由环境因子（季节、试验地点和年份）引起的。

品质性状相关转基因植物对土壤微生物的影响

近年来，利用转基因技术已经培育出一些用于改良品质性状（如改变淀粉成分、调节植物激素平衡、提高果实紧实度等）的转基因植物，因此其对土壤微生物的影响也需要得到认真评估。

有研究报道，产淀粉酶和木质素过氧化物酶的转基因紫花苜蓿（Medicago sativa）与亲本紫花苜蓿的根际细菌类型存在差异，转基因紫花苜蓿根际土壤中可培养的需氧产孢和利用纤维素的细菌数量比亲本紫花苜蓿显著提高。利用磷脂脂肪酸（PLFA）法分析转基因品质改良（富含硫氨基酸）大豆对土壤微生物群落结构的影响，结果表明转基因大豆的种植影响根际土壤微生物群落结构。产玉米黄质（zeaxanthin）转基因马铃薯和亲本马铃薯品系的根际放线菌（Actinobacteria）、B-变形菌（Betaproteobacteria）和链霉菌（Streptomycetaceae）细菌群落发生显著变化，而且根际真菌群落的变化更明显。但也有研究表明，产果聚糖转基因马铃薯对根际土壤细菌种群无明显影响。

其他特性转基因植物对土壤微生物的影响

此外，一些特殊性状，如提高环境胁迫耐受力、过量表达硝基还原酶或铁蛋白等的转基因植物，也可能对土壤微生物群落多样性产生一定影响。利用16S-23S rRNA基因间隔区（intergenic spacer region，ISR）的研究表明，转抗逆基因DREBlA的马铃薯对微生物基因型结构有较小的影响，而且一些基因型只在种植转基因植物的土壤中出现。采用传统的平板计数法和PCR凝胶电泳技术检测发现，具有胁迫抗性的转甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因的苜蓿对土壤微生物系统没有明显的影响。2011年，李（B.Lee）等利用T-RFLP技术分析了表达海藻糖-6-磷酸合成酶的转基因水稻对土壤微生物的影响，结果表明转基因水稻对土壤细菌和真菌群落无明显影响。2012年，董蕾利用DGGE技术进行的研究表明，转DREB3基因抗旱大豆对土壤微生物无明显影响。

进行评价时需考虑的因素

有关转基因植物对土壤微生物的影响，已进行了大量研究，但是未得出一致的结论，甚至还得出了一些彼此完全相反的结果。究其原因，可能是众多研究者所选择的转基因植物品种各不相同。另外，试验地点选择的差异也会对实验结果产生很大影响。总体来看，相对于环境因素（干旱、作物病虫害、气候变化）、生育时期，以及农作物管理措施（施肥、灌水、施药、轮作）而言，转基因植物的种植没有造成土壤微生物群落的显著改变。简言之，转基因植物对土壤微生物的影响依赖于许多因素。因此在评估转基因作物对土壤微生物的影响及潜在风险时，首先应考虑哪些因素影响土壤微生物群落的多样性。这些因素是复杂多样的，总体分为生物因素和非生物因素两大类。

生物因素主要包括：植物的不同发育阶段和不同物种，同一物种不同栽培品种之间的差异，作物的轮作情况，以及植物根系延伸可能涉及的土壤范围。研究表明，这些生物因素在一定程度上可能会影响土壤微生物群落的组成，从而不可预见地导致出现或缺失某些特定的微生物类群。在评价转基因植物对土壤微生物的影响时，要充分考虑这些因素对分析结果的影响。例如有研究发现，转基因土豆品系SIBU SI与受体亲本（非转基因土豆）SIBU之间根际土壤微生物的差异小于受体亲本SIBU与常规非转基因栽培品种SOLANA之间的差异，由此可以推断，转基因土豆对土壤微生物没有影响或影响甚微。

非生物因素主要包括：不同的土壤类型，季节变化，耕地情况，肥料的使用，以及污水灌溉。研究表明，不同的农田管理措施如耕作方式，肥料、农药和除草剂的使用等，对土壤微生物有重要的影响。巴留索（J.Barriuso）等人在2012年采用焦磷酸测序新技术证实，转Bt基因对玉米田土壤微生物群落的影响远小于气象因子。在精确评估转基因作物对土壤微生物的影响时，恰当的实验设计应考虑控制农田生态系统中这些因子的自然变化，也应该考虑取样过程中空间和时间的变化。例如，种植转Bt作物能够避免使用杀虫剂，那么不使用杀虫剂对根际微生物的影响也应该同时得到评估。

展望

土壤中的微生物群落在整个农业生态系统中具有其他生物所不可替代的作用。各种转基因植物的大面积种植对土壤微生物有何潜在危险，对农业生态系统有何影响，已成为研究之热点。有诸多报道表明，转基因植物对土壤微生物有显著作用，其给环境带来的潜在风险是今后人类推广转基因植物时所面临的重大挑战之一。也有研究认为，尽管转基因植物对土壤微生物没有显著影响，但随着时间的积累及生物富集作用的不断扩大，其危害性可能会逐步显现，且存在高度的不可预见性。

目前。人们在转基因植物影响土壤微生物安全性这一方面，研究还不够全面深入，所取得的研究成果差异颇大，迄今的研究结果尚无定论。可能的原因在于，土壤微生物群落中各组分和功能之间的相互关系尚不明确，无法准确评价土壤系统自然变化对土壤微生物群落结构和功能的影响，关于转基因植物对土壤微生物影响之程度也需深入研究。此外，土壤微生物学研究中所采用方法的局限性也是导致研究结论各异的重要原因。要认识到该领域的研究具有长期性和复杂性，需要从不同的角度、综合多种研究手段或开发新的研究策略来开展研究，以进一步阐明转基因植物与土壤微生物之间互相影响的实质联系。

从上述认识出发，开展转基因植物的土壤微生物安全性评价，必须建立合理规范的土壤微生态学水平的评估方法和理论体系，加强传统培养方法与现代生物化学和分子生物学方法的联合应用，同时对不同转基因植物进行个案分析，结合长期的田间试验观察，争取在不久的将来能够清晰地揭示转基因植物对人类和环境之潜在影响，进一步完善对转基因植物的安全性评价体系，使得转基因技术拥有更广阔的顺利发展空间，并成为真正造福于人类的先进技术。