天葵提取物对小鼠免疫功能的影响*

武 飞，张闽闽，罗 明，徐 冉，王建塔，汤 磊，梁 冰＊

(1.贵州医科大学 药理学教研室，贵州 贵阳 550025;2.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550025)

天葵［semiaguilegia adoxoides(DC.)makino］为毛茛科天葵属多年生草本植物，其块根及种子可供药用，具有清热解毒、消肿散结之功效，用于治疗乳腺炎、扁桃体炎、痈肿、瘰疬、小便不利以及毒蛇咬伤等症［1－2］。天葵营养较为丰富，微量元素钙、锰、铁、锌、铜等含量较高，其含有的黄酮甙成分对恶性生长细胞亦有一定对抗作用。此外，天葵还有抗寄生虫和抗病毒的作用，可增强人体的免疫能力［3］。本研究采用碳粒廓清法、半数溶血值法以及环磷酰胺诱导的免疫抑制模型，综合评价天葵提取物(TK)对小鼠免疫功能及肝、肾功能的影响，为天葵的进一步研究开发及临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级昆明种小鼠，18 ～22 g，雌雄各半，由贵州医科大学实验动物中心提供。动物合格证号SYXK(黔2012－0001)。

1.1.2 TK 的制备 天葵药材购于贵阳市药材市场，经贵阳医学院龙庆德副教授鉴定为毛茛科天葵属植物天葵的干燥块根，产地贵州。将购买的天葵干燥粉碎，依次用甲醇回流提取和正丁醇萃取，得到天葵－正丁醇提取物，于－20 ℃保存，临用时用蒸馏水稀释至所需浓度(1 mg 天葵－正丁醇提取物相当于生药量20.7 mg)。

1.1.3 主要试剂 环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司，14011725)，谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为C010－1;C009－1;C013－1);绵羊红细胞(SRBC)由贵阳医学院实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 TK 急性毒性实验 经预实验，未测到TK对小鼠的LD50，因此进行小鼠最大耐受量实验。取小鼠20 只，雌雄各半，随机分为给药组和正常对照组，每组10 只。给药组予5 g/kg TK、2 次/d 灌胃，连续14 d，观察小鼠的反应;正常对照组给予等量的生理盐水［4］。

1.2.2 碳粒廓清实验 取小鼠40 只，雌雄各半，随机分成4 组，TK 设高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)剂量组和正常对照组(简称对照组)。各组每天灌胃1 次，连续7 d。对照组给予等量生理盐水。于末次给药后24 h，从小鼠尾部静脉注入稀释的(1∶4)印度墨汁0.1 mL/10 g，分别于2 min(t1)、10 min(t2)后从眼眶内眦静脉丛取血20 μL，并立即加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，600 nm 波长处测t1、t2时的吸光度值A1、A2。取血完毕同时，将小鼠颈椎脱臼处死，取其肝脏、胸腺和脾脏，称重。计算碳廓清指数K、吞噬指数α、脾脏指数以及胸腺指数［5］(公式中m 为重量)。

碳廓清指数K=(log A1－log A2)/(t2－t1)

吞噬指数α=m(动物)/m(肝脏+脾脏)×K1/3

脾脏指数=m(脾脏)/m(动物体重)×100%

胸腺指数=m(胸腺)/m(动物体重)×100%

1.2.3 血清溶血素形成实验 取小鼠40 只，雌雄各半，随机分成TK 高、中、低剂量组和对照组(简称对照组)(方法同1.2.2)。给药组每天灌胃1 次，连续10 d;对照组给予等量生理盐水。于给药第6 天每只鼠腹腔注射绵羊红细胞悬液(SRBC)0.2 mL，第11 天摘除眼球取血，分离血清，用生理盐水稀释400 倍。取上述稀释好的血清样品1 mL，放入冰水浴中，依次加入10%的SRBC 0.5 mL，加入1∶10 的稀释豚鼠血清1 mL，另设不加补体以生理盐水代替的空白对照管，37 ℃孵育10 min 后，放入冰浴中终止反应。2 000 r/min 离心10 min，取上清1mL，加入3 mL 都氏液，混匀，放置10 min，于540 nm 波长处比色。按下式计算每个样品的HC50，以半数溶血值HC50表示血清溶血素水平。

另取0.25 mL 经洗涤过的SRBC 悬液，用都氏试剂稀释至4 mL，摇匀放置10 min，于540 nm 波长处比色，得到SRBC 半数溶血时的吸光度值。以上各组小鼠眼球取血后，立即颈椎脱臼处死，分别取胸腺、脾脏，称重并计算胸腺指数和脾脏指数(方法同1.2.2)。

1.2.4 CTX 诱导的免疫抑制小鼠模型 取小鼠50 只，雌雄各半，随机分成5 组，分别为TK 高、中、低剂量组(方法同1.2.2)、正常对照组(简称对照组)以及CTX 免疫抑制模型组(简称模型组)。对照组和模型组灌胃给予生理盐水0.2 mL/10 g;药物高、中、低剂量组灌胃给予相应剂量TK，每日1次，连续11 d。第9、10 和11 天灌胃后，模型组和药物组腹腔注射CTX 100 mg/(kg·d);对照组注射等量生理盐水［6］。第12 天，小鼠称重后摘眼球取血，分离血清，检测血清中的ALT、AST、BUN 的含量。以上各组小鼠眼球取血后，立即颈椎脱臼处死，取其胸腺、脾脏，称重并计算胸腺指数和脾脏指数(方法同1.2.2)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TK 急性毒性实验

经预实验，未测到TK 对小鼠的LD50，在最大给药浓度和最大给药体积下，小鼠生长良好，未见死亡;两组小鼠的体重变化情况见表1。

2.2 TK 对小鼠巨噬细胞的吞噬指数和免疫器官脏器指数的影响

与对照组相比，TK 高、中剂量组吞噬指数增加，脾脏指数增加，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表1 TK 对小鼠体重的影响Tab.1 Effcet of TK on mouse weight in different periods

表1 TK 对小鼠体重的影响Tab.1 Effcet of TK on mouse weight in different periods

组别 n 给药前3 d小鼠7体d重(g)10 d 14 d对照组 10 19.1±1.4 19.8±1.6 21.2±1.8 24.3±1.8 28.5±2.2给药组 10 18.8±1.6 19.6±2.0 20.8±2.1 23.6±1.9 27.7±2.1

表2 TK 对小鼠吞噬指数及免疫器官脏器指数的影响Tab.2 Effect of TK on index of phagocytosis and viscera of mice

表2 TK 对小鼠吞噬指数及免疫器官脏器指数的影响Tab.2 Effect of TK on index of phagocytosis and viscera of mice

(1)与对照组相比，P ＜0.05

组别 n 吞噬指数α 胸腺指数 脾脏指数对照组10 2.67±0.54 2.54±0.37 3.57±0.32 TK 高剂量组 10 4.46±0.71(1) 2.28±0.23 4.84±0.38(1)TK 中剂量组 10 3.28±0.56(1) 2.32±0.57 4.24±0.66(1)TK 低剂量组10 2.78±0.48 2.73±0.32 3.84±0.37

2.3 TK 对小鼠血清溶血素及免疫器官脏器指数的影响

与对照组相比，TK 高、中剂量组HC50增加，脾脏指数增加，差异具有统计学意义(P ＜0.05)。见表3。

表3 TK 对小鼠HC50及免疫器官脏器指数的影响Tab.3 Effect of TK on HC50 and index of viscera of mice

表3 TK 对小鼠HC50及免疫器官脏器指数的影响Tab.3 Effect of TK on HC50 and index of viscera of mice

(1)与对照组相比，P ＜0.05

组别 n HC50胸腺指数 脾脏指数对照组10 148.93±25.06 3.17±0.28 4.58±0.22 TK 高剂量组 10 279.25±47.17(1) 3.47±0.24 5.93±0.47(1)TK 中剂量组 10 185.20±25.92(1) 2.93±0.47 5.24±0.27(1)TK 低剂量组10 146.84±20.24 2.72±0.29 4.92±0.41

2.4 TK 对CTX 免疫抑制小鼠肝、肾功能及免疫器官脏器指数的影响

与对照组相比，模型组小鼠血清ALT、AST、BUN 含量升高，胸腺指数、脾脏指数降低;与模型组相比，TK 各剂量组血清中的ALT、AST 及BUN含量明显降低，高、中剂量组脾脏指数升高，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表4。

表4 TK 对CTX 免疫抑制小鼠肝肾功能及脏器指数的影响Tab.4 Effect of TK on the function of liver，kidney and index of viscera in the immunosuppressive mice induced by CTX

表4 TK 对CTX 免疫抑制小鼠肝肾功能及脏器指数的影响Tab.4 Effect of TK on the function of liver，kidney and index of viscera in the immunosuppressive mice induced by CTX

(1)与对照组比，P ＜0.05;(2)与CTX 模型组比，P ＜0.05

指标 对照组 模型组 TK 高剂量组 TK 中剂量组 TK 低剂量组ALT(U/L) 50.25±8.69 136.10±16.41(1) 80.36±13.67(2) 93.72±10.45(2) 111.78±9.62(2)AST(U/L) 80.35±12.35 185.47±20.13(1) 115.72±18.45(2) 128.12±13.37(2) 146.82±11.78(2)BUN(mmol/l) 109.17±13.16 175.83±20.47(1) 153.96±18.20(2) 148.34±15.39(2) 125.21±9.27(2)胸腺指数 3.64±0.30 1.87±0.10(1) 1.62±0.08 1.84±0.05 2.02±0.07脾脏指数 4.67±0.20 3.18±0.30(1) 5.12±0.20(2) 4.58±0.40(2)3.87±0.10

3 讨论

天葵作为一种民间用药，具有较高的营养价值和较强的保健功效，近年来备受人们的青睐。但目前国内外对天葵免疫功能的研究还鲜见报道。本实验主要从多方面综合探讨了天葵对小鼠免疫功能的影响。

机体的免疫功能主要分为非特异性免疫和特异性免疫。特异性免疫主要包括细胞免疫和体液免疫。单核巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一。而碳粒廓清实验常用于评价巨噬细胞吞噬能力，吞噬指数越高说明巨噬细胞的吞噬能力越强。本实验观察了TK 对正常小鼠吞噬指数的影响，结果表明，TK 高剂量和中剂量组对正常小鼠巨噬细胞的吞噬能力有显著的促进作用，能提高小鼠非特异性免疫功能。血清溶血素形成实验常用于评价体液免疫功能。本次实验测定了小鼠血清中HC50值，结果表明，天葵提取物高、中剂量可显著提高正常小鼠HC50值，说明天葵提取物可增强小鼠的体液免疫功能。胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，胸腺的主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素，主要参与细胞免疫;脾脏中有丰富的淋巴细胞和巨噬细胞，但B 淋巴细胞比例较大，因此与体液免疫关系更为密切。本研究结果显示，天葵提取物对正常小鼠脾有增重作用，亦能对抗CTX 引起的脾萎缩，因而对促进小鼠的体液免疫有一定作用。CTX 作为免疫抑制剂，在临床应用过程中具有一定的肝、肾毒性。本次实验观察了TK 对CTX 诱导的免疫抑制小鼠肝肾功能的影响。ALT 和AST 主要存在于肝脏中，当肝细胞损伤或坏死时，肝细胞内的ALT 和AST 释放入血，导致血液中酶含量相应升高。BUN 是人体蛋白质代谢的主要终末产物，在肾功能正常的情况下，BUN 从肾小球滤过。当肾脏损伤时，肾小球滤过功能减低，BUN 因潴留而增高，故其可用作反映肾功能的指标。本次实验检测了CTX 免疫抑制小鼠血清中的ALT、AST、BUN 含量，结果表明TK 能够降低血清中的ALT、AST、BUN 的含量，提示TK能够对抗CTX 引起小鼠肝、肾的损伤。

综上所述，TK 能增强小鼠的免疫功能，并对小鼠的肝、肾功能具有一定的保护作用，其作用机制尚待进一步的深入研究。

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