子宫内膜异位症与TNF-β G252A 基因的相关性研究

余鸿标，姚吉龙

(1.深圳市罗湖医院 妇科，深圳 罗湖 518000;2.深圳市妇幼保健院 妇科，深圳 福田 518000)

子宫内膜异位症(endometriosis，Ems)是一种生育期妇女常见的疾病，指腺体和间质等子宫内膜组织在子宫肌层以外的位置出现生长和浸润，可导致痛经乃至不孕，发生率为10%～15%［1－2］。Ems具有明显的家族聚集性，患者的直系亲属患病率是无家族史患者的6 ～7 倍［3］。有研究证实肿瘤坏死因子(TNF)与其它促血管生成因子之间的相互作用能够共同促进新血管生成，而血管的建立和维持是Ems 发生、发展的重要环节。肿瘤坏死因子β(TNF-β)是体内T 细胞产生的淋巴毒素，基因位于HLA-β 和HLA-C2 之间，与MHC 基因及TNF-α 基因紧密连锁［4］。TNF-β 基因+252 位点的等位基因G/A 位于第1 启动子，与限制性内切酶的识别密切相关，是TNF-β 基因上最主要的多态性位点。本研究通过测定TNF-β 基因+252 位点的基因多态性和血清中TNF-β 的含量，分析Ems 与TNF-β G252A 基因之间的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

2013 年7 月～2014 年7 月经腹腔镜和病理确诊的Ems 患者80 例作为Ems 组，根据参考文献［5］进行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期45 例，Ⅲ～ Ⅳ期35例;21 ～40 岁，平均(30.15±5.25)岁。需经腹腔镜等手段排除Ems 的适龄妇女80 例作为对照组，22 ～41 岁，平均(30.17±5.20)岁。全部受试者间均为无血缘关系，饮食结构相似，两组受试者基础资料比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)。排除糖尿病疾病、肿瘤、甲状腺肝肾功能不全及严重营养不良并使用过激素治疗的患者。

1.2 方法

1.2.1 TNF-β 的含量测定［6］全部受试者均采用腹腔镜在空腹时抽取静脉血3 mL，3 500 r/min 离心10 min 后收集上清，分2 ～3 管置－70 ℃保存。采用TNF-β 酶联免疫试剂盒(购自上海森雄科技实业有限公司)按照说明检测血清中TNF-β 含量，每份标本做2 个副孔孔。

1.2.2 TNF-β G252A 位点多态性检测［7］采用酚－氯仿法提取白细胞中的DNA［8］，设计并合成(大连宝生物工程有限公司)PCR 引物［11］。TNF-β G252A 上游引物为5'-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3'，下游引物为5'-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3'。PCR 体系50 μL(含10×缓冲液6 μL，2 mol/μL 的dNTP 3 μL，上、下游引物浓度0.4 mol/L，基因组DNA 0.1 μg，Taq DNA 聚合酶2U)。循环条件:94 ℃预变性5 min，94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃1 min，35 个循环，72 ℃延伸5 min。结果判定:出现555 bp、185 bp 两条带为G 等位基因纯合子(TNF-β 1/1 型);555 bp、185 bp、740 bp 3 条带为G/A 杂合子(TNF-β 1/2 型);仅出现740 bp一条带为A 等位基因纯合子(TNF-β 2/2 型)。

1.3 统计学处理

数据使用SPSS 13.0 统计软件分析，计量资料采用均数±标准差表示，两样本均数比较采用t 检验，计数资料采用率(%)表示，比较采用χ2检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清TNF-β 含量与EMT 分期的相关性

Ems 组血清中TNF-β 含量明显高于对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05);Ems 组Ⅲ、Ⅳ期患者血清TNF-β 含量明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者，差异有统计学意义(P ＜0.05);见表1。Ems 组血清中TNF-β 的含量与EMT 分期之间正相关(r=0.853 2)。

表1 子宫内膜异位症组与对照组血清TNF-β 含量Tab.1 The levels of TNF-β in Ems group and the control group

2.2 TNF-β G252A 位点多态性及分布

PCR 扩增结果显示Ems 组和对照组均检出TNF-β G252A 位点G/A 突变。TNF-β G252A 多态位点不同基因型如图1 的电泳图谱所示。两组间各基因型分布差异有统计学意义(P ＜0.05)，A/A基因型及G/A 基因型频率在Ems 组中均高于对照组。而A/A 基因型患内异症的危险度是G/G 基因型的3.5 倍。见表2。

图1 TNF-β G252A 位点扩增产物电泳结果Fig.1 Electrophorersis results of PCR product of TNF-β G252 gene

表2 Ems 组与对照组TNF-β G252A 位点基因型频率Tab.2 Comparison of genotypic frequencies of TNF-β 252 gene between Ems group and control group

3 讨论

Ems 是一类良性肿瘤，但具有能够侵袭转移和复发的特点。对于TNF 基因与Ems 之间的关系，学说众多却均无定论。因此，探明其中的关系，对于Ems 的诊断、治疗及预后方面将有重大意义［1－2］。

本研究中，实验组血清中测得TNF-β 含量显著高于对照组(P ＜0.05)，实验组Ⅲ、Ⅳ期明显高于Ⅰ、Ⅱ期(P ＜0.05)，实验组血清中TNF-β 的含量与EMT 分期之间正相关(r=0.853 2)。这可能是因为TNF 是重要的血管生成因子，可促进内膜异位灶的血管形成和盆腔粘连［5］。在Ems 早期TNF-β 可诱导产生多种细胞因子如IL-1、IL-6 等炎症介质调控并促使种植灶中新生血管的生长、分化，最终形成内异症病灶。过量的TNF 又可降低机体的免疫状态，使得Ems 进一步发生、发展。因此，会伴随着Ems 病情的加重，患者体内血清中TNF-β 的浓度会逐步增高。

此外，两组间各基因型分布差异有统计学意义(P ＜0.05)，A/A 基因型及G/A 基因型频率在实验组中均高于对照组。而A/A 基因型患Ems 的危险度是G/G 基因型的3.5 倍。说明等位基因A 将使Ems 的患病概率明显增加，与张良等［9］的报道一致，但与车坤兰等［10］报告的实验组和对照组间无差异结果不同。主要原因在于单一基因对Ems发病的作用，更多的受到了种族、生存环境、饮食习惯等因素的影响，探究多基因同疾病的关系更具借鉴意义。

综上，Ems 患者血清中TNF-β 的含量与EMT的分期呈正相关，A/A 基因型是患Ems 的危险基因型。但是由于单一基因对Ems 发病的作用会受到了种族、生存环境、饮食习惯等因素的影响，同时存在研究样本量偏少等问题，需要进一步加大样本量研究。

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［10］车坤兰，罗程，何凤仪，等.子宫内膜异位症与肿瘤坏死因子TNFα-308G/A 和TNFβG252A 基因多态性的关系［J］.解剖学研究，2010(1):21－24.