依普利酮对高盐诱导的高血压大鼠主动脉内皮型一氧化氮合酶表达及活性的影响*

张　倩，丁　菁，杨　飞，王胜男，粟　凤，陆德琴(贵州医科大学病理生理学教研室，贵州贵阳550025)

依普利酮对高盐诱导的高血压大鼠主动脉内皮型一氧化氮合酶表达及活性的影响*

张倩，丁菁，杨飞，王胜男，粟凤，陆德琴△
(贵州医科大学病理生理学教研室，贵州贵阳550025)

［摘要］目的:探讨依普利酮对高盐诱导的高血压大鼠主动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达及活性的影响。方法: 50～60 g 4周龄雄性Wistar大鼠随机分为3组:对照(control，C)组用普通饲料饲养16周，高盐饮食(high salt diet，HS)组及依普利酮(eplerenone，Epl)组用5%高盐饲料饲养16周，C组和HS组于末4周给予同等剂量生理盐水灌胃，而Epl组于末4周给予依普利酮40 mg· kg(－1)·d(－1)灌胃。每2周检测各组大鼠尾动脉收缩压，16周后处死大鼠，留取主动脉。ELISA法检测醛固酮含量，蛋白免疫印迹法检测盐皮质激素受体(MR)及eNOS蛋白表达水平，化学比色法测定一氧化氮合酶活性，免疫组化染色法观察主动脉eNOS、神经型一氧化氮合酶(nNOS)及MR蛋白表达与定位。结果: (1)高盐饲料饲养8周后，大鼠收缩压即明显升高，并逐渐上升，16周时HS组收缩压较同时点C组明显升高(P＜0.05) ;依普利酮灌胃4周后，收缩压比灌胃前明显下降(P＜0.05)。(2)与C组比较，HS组、Epl组主动脉醛固酮含量明显增加(P＜0.05)，且MR表达明显增加(P＜0.05)。(3) HS组较C组eNOS蛋白表达减少(P＜0.05)、结构型一氧化氮合酶(cNOS)活性也降低(P＜0.05) ; Epl组较HS组eNOS蛋白表达增加(P＜0.05)、cNOS活性增高(P＜0.05)。结论: (1)高盐诱导高血压大鼠的主动脉醛固酮含量明显增加，醛固酮可能通过激动MR降低主动脉eNOS蛋白表达及酶活性。(2)选择性MR拮抗剂依普利酮可恢复eNOS蛋白表达及活性，改善eNOS功能。

［关键词］高血压;高盐饮食;内皮型一氧化氮合酶;盐皮质激素受体

［修回日期］2015-07-14

长期高盐饮食是血压升高的一个重要原因［1］。盐敏感性高血压的发生是多种机制共同作用的结果，包括遗传机制、神经机制、内皮功能障碍机制、肾素血管紧张素醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)机制等［2］。RAAS各组分及盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor，MR)在心、脑、血管及肾脏等组织中都有表达［3］。易卒中自发性高血压大鼠摄入高盐后，肠系膜动脉组织醛固酮合酶基因表达增高［4］。血管内皮细胞长期暴露于醛固酮后，可造成一氧化氮合成减少，导致内皮功能障碍［5］。内皮细胞合成的内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化产生的一氧化氮具有扩张血管、调节血压、抑制血管平滑肌细胞增殖等维持血管稳态的作用［6］。为探讨高盐性高血压时动脉血管组织中醛固酮含量是否升高，选择性MR拮抗剂对动脉内皮eNOS功能是否具有保护作用，本课题以高盐诱导的高血压大鼠为研究对象，观察主动脉醛固酮含量的变化以及依普利酮(eplerenone，Epl)对eNOS表达水平及酶活性的影响。

材料和方法

1试剂

依普利酮购自大连美仑生物技术有限公司;兔抗鼠eNOS抗体、抗鼠微管蛋白β-tubulin抗体、抗鼠MR抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自Santa Cruz;兔抗鼠nNOS抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司;大鼠醛固酮ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司;一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性测定试盒购自南京建成生物工程研究所。

2方法

2.1实验动物及分组50～60 g 4周龄清洁级雄性Wistar大鼠，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物合格证号为SCXK(湘) 2009-0012。适应性喂养1周后随机分为3组，每组21只。对照(control，C)组用啮齿类动物粉末饲料自制成薄块状饲养16周，高盐饮食(high-salt diet，HS)组用啮齿类动物粉末饲料内加入5%食盐后制成薄块状的饲料饲养16周，Epl组用啮齿类动物粉末饲料内加入5%食盐后制成薄块状的饲料饲养16周。于第13周开始，Epl组用依普利酮40 mg ·kg－1·d－1灌胃4周，其余2组用同等剂量生理盐水灌胃4周。

2.2尾动脉无创血压监测及高血压的判定用成都泰盟BP-600A型大鼠无创血压测量仪测定大鼠收缩压。将套袖套在鼠尾根部，放入仪器内适应10 min～15 min后，自动充气加压测量。每次测量6个数值，取平均值为当天收缩压值。因4周龄幼鼠尾动脉过细，无法测量血压，故饲养4周后开始测量，每2周测量1次。凡收缩压值≥115 mmHg，且比同时点C组收缩压均值≥20 mmHg者，判定为高血压［7］。

2.3主动脉采集大鼠处死前禁食10 h，3%戊巴比妥钠(0.15 mL/100 g体质量)腹腔麻醉后快速剪取胸主动脉放入冰上预冷PBS中，迅速轻柔剔除血管外脂肪、结缔组织后放入液氮中冻凝，置－70℃保存待用。

2.4主动脉醛固酮含量测定取出冻存的主动脉组织，在液氮中研磨至细粉末状，转移至已加入预冷PBS的离心管中，放入－70℃反复冻融2次破膜，离心后取上清检测，操作步骤严格按照ELISA检测试剂盒说明书完成。

2.5主动脉结构型NOS(constitutive NOS，cNOS)活性检测取出冻存主动脉组织，在液氮中研磨后，置入预冷组织匀浆介质中，冰上裂解后离心取上清液检测cNOS的活性，操作步骤严格按照试剂盒说明书完成。

2.6Western blot检测主动脉eNOS、MR蛋白的表达水平蛋白样品制备后，行SDS-PAGE，再将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后I抗(各抗体稀释比例如下:兔抗鼠微管蛋白β-tubulin抗体为1∶1 000;兔抗鼠eNOS抗体为1∶800;兔抗鼠MR抗体为1∶400) 4℃孵育过夜。羊抗兔II抗(1∶5 000)孵育后，ECL显影定影。电泳条带用Bio-Rad凝胶图像分析软件分析，将各条带积分光密度值分别与相应的β-tubulin条带积分光密度值相比，以每次电泳的C组第1个样品蛋白条带的积分光密度值为100%，其余样品蛋白条带与之相比计算积分光密度值的百分比作为蛋白质表达的相对水平。

2.7免疫组化SABC法定位eNOS、nNOS、MR蛋白的表达主动脉常规石蜡病理切片完成脱蜡、水化后，用3% H2O2封闭，0.01 mol/L Tris-EDTA抗原修复，正常山羊血清工作液封闭，兔抗鼠I抗4℃孵育过夜(eNOS及nNOS稀释比例为1∶100，MR为1∶50，阴性对照用PBS代替I抗，同时用大鼠脑组织病理切片设立nNOS阳性对照)。37℃复温后羊抗兔II抗孵育，DAB镜下显色，苏木素复染，脱水，透明，固定，中性树胶封片。在400倍普通光镜下，每例标本随机选取5个视野进行观察，以细胞浆内出现棕黄色颗粒判定为阳性表达。

3统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件进行分析。数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，组内、组间比较采用单因素方差分析，各组不同时点收缩压值比较采用重复测量资料的方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1各组收缩压的变化情况

随着年龄的增长，C组大鼠收缩压逐渐升高，实验8周时升高至(95.25±1.55) mmHg，此后收缩压保持相对恒定。高盐饲养8周后大鼠收缩压开始升高(P＜0.05)，并呈逐渐上升趋势，16周时与同时点C组相比，HS组大鼠收缩压明显升高(P＜0.05)。依普利酮灌胃4周后，Epl组大鼠收缩压与灌胃前相比明显下降(P＜0.05)，且低于同时点HS组(P＜0.05)，见表1。

表1　各组收缩压变化Table 1.The changes of systolic blood pressure in the rats with different treatments (mmHg.Mean±SD.n=21)

2各组主动脉醛固酮含量

ELISA法检测结果发现，与C组相比，HS组及Epl组主动脉醛固酮含量明显增高(P＜0.05)，见图1。

3各组主动脉MR水平

蛋白免疫印迹法检测结果发现，与C组相比，HS组及Epl组MR水平明显升高(P＜0.05)，见图2。

4各组主动脉MR表达的定位

与C组比较，HS组主动脉内皮细胞内棕黄色颗粒明显增多，平滑肌细胞亦可见棕黄色颗粒增加，提示MR表达明显增加。给予依普利酮治疗后，内皮细胞及平滑肌细胞MR阳性表达仍明显高于C组，见图3。

Figure 2.The expression level of MR in the aorta of the rats with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs C group.图2各组主动脉MR水平

5各组主动脉eNOS蛋白表达水平

与C组相比，HS组eNOS蛋白表达水平明显下降(P＜0.05) ;与HS组相比，Epl组eNOS蛋白水平明显增高(P＜0.05)，且高于C组(P＜0.05)，见图4。

Figure 3.The protein expression of MR in the aorta of the rats with different treatments (×400).图3各组主动脉MR蛋白表达定位

Figure 4.The protein expression of eNOS in the aorta of the rats with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs C group;#P＜0.05 vs HS group.图4各组主动脉eNOS蛋白表达水平

6各组主动脉eNOS和nNOS表达的定位

与C组比较，HS组内皮细胞内棕黄色颗粒减少，提示eNOS表达减少;与HS组比较，Epl组内皮细胞内棕黄色颗粒增多，eNOS表达明显增加，见图5。

图6显示，nNOS表达阳性对照样本正常大鼠脑组织神经细胞胞浆内存在大量棕黄色颗粒，而在C组、HS组及Epl组的主动脉内皮细胞和平滑肌细胞的胞浆内可见很少量棕黄色颗粒，表明nNOS在大鼠主动脉呈低水平表达。用图像分析系统计算平均灰度值进行蛋白半定量分析，结果显示3组间nNOS表达水平差异不显著。

7各组主动脉的cNOS活性

与C组相比，HS组主动脉cNOS活性明显降低(P＜0.05) ;与HS组相比，Epl组cNOS活性明显增高(P＜0.05)，见图7。

Figure 5.The protein expression of eNOS in the aorta of the rats with different treatments (×400).图5各组主动脉eNOS蛋白表达定位

Figure 6.The protein expression of nNOS in the aorta of the rats with different treatments (×400).图6各组主动脉nNOS蛋白表达定位

讨论

盐敏感性高血压的发病机制复杂，其中包括内皮功能障碍和RAAS系统激活等机制［2］。高盐饲养Wistar大鼠心脏组织中MR水平明显增高［8］。本实验研究发现，5%高盐饲料饲养Wistar大鼠8周后血压即升高，并呈逐渐上升趋势，16周时大鼠血压升高更为显著，同时主动脉醛固酮含量及MR水平也显著增高，结果与文献报道是一致的，其机制有待进一步研究。

Figure 7.The activity of cNOS in the aorta of the rats with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs C group;#P＜0.05 vs HS group.图7各组主动脉cNOS活性

主动脉醛固酮含量及MR表达水平增高，是否会影响血管内皮细胞的功能呢?血管内皮细胞对维持血管正常的舒缩功能和调节血压起着重要的作用，已公认eNOS活性变化是血管内皮功能变化的一个敏感指标。已有文献表明，用4% NaCl喂养10周的Dahl盐敏感性高血压大鼠，主动脉eNOS的活性明显降低［9］;感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠主动脉eNOS mRNA和蛋白表达均明显降低［10］。MR拮抗剂可竞争性拮抗醛固酮与MR的结合，增加一氧化氮的生物利用度，改善高血压、动脉粥样硬化和心衰过程中的内皮功能紊乱［5，11］。离体水平的研究也发现，用醛固酮处理人脐静脉内皮细胞24 h后，eNOS蛋白表达降低，给予非选择性MR拮抗剂螺内酯预处理，可使eNOS蛋白表达增加［12］。目前临床上使用的MR拮抗剂有非选择性的螺内酯和选择性较强的依普利酮2种。依普利酮对醛固酮引起的内皮功能紊乱、氧化损伤和盐敏感性高血压等，均能起到较好的保护作用［5］。

本实验从大鼠整体水平，选用MR选择性拮抗剂依普利酮对高盐诱导的高血压进行治疗，结果显示，高盐饲养大鼠可使主动脉eNOS蛋白表达减少、cNOS活性降低，依普利酮治疗后可恢复eNOS蛋白表达水平，同时使cNOS活性恢复。因cNOS包括eNOS和nNOS2种亚型，故cNOS活性应为2者活性之和。为排除nNOS活性变化对cNOS活性的影响，本实验用免疫组化染色法观察了主动脉nNOS阳性表达变化。由3组间cNOS活性变化及nNOS表达差异不显著的结果可知，HS组主动脉eNOS活性较C组降低，依普利酮治疗后eNOS活性有所增加。因此，本实验结果提示，大鼠摄入高盐后主动脉醛固酮含量增加，eNOS蛋白表达及活性下降，eNOS的变化可能是由于主动脉内含量增加的醛固酮激动MR后所致。选择性MR拮抗剂依普利酮，虽未降低醛固酮含量及MR表达水平，但拮抗了醛固酮与MR的结合，阻断了醛固酮对eNOS的影响，使eNOS蛋白表达及活性升高，改善血管内皮功能，发挥了保护作用。关于醛固酮激动MR后导致eNOS表达降低、使酶活性降低的机制，以及依普利酮增加eNOS表达水平，从而增加酶活性的分子机制，有待下一步深入研究。

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(责任编辑:林白霜，余小慧)

Effects of eplerenone on expression and activity of aortic endothelial nitric oxide synthase in hypertensive rats induced by high-salt intake

ZHANG Qian，DING Jing，YANG Fei，WANG Sheng-nan，SU Feng，LU De-qin
(Department of Pathophysiology，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China.E-mail: dqlu91@hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the effects of eplerenone on the expression and activity of aortic endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in high salt-induced hypertensive rats.METHODS: Male Wistar rats (4 week old，weighting 50～60 g) were randomly divided into control group，high-salt diet group and eplerenone group.The rats in control group were fed with ordinary rodent animal diet，the rats in high-salt group and eplerenone group were exposed to 5% salt diet for 16 weeks and administrated with the same dosage of saline or eplerenone (40 mg· kg(－1)·d(－1)) by gavage for 4 weeks，respectively.Systolic blood pressure (SBP) was measured by tail-cuff every 2 weeks.The rats were sacrificed after 16 weeks and the thoracic aorta was collected.The aldosterone content in the aorta was measured by ELISA.The protein levels of mineralocorticoid receptor (MR) and eNOS were determined by Western blot.The activitie of constitutive NOS (cNOS) was measured by chemocolorimetry.The protein localization of eNOS，neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and MR was observed by immunohistochemistry.RESULTS: A process of 8-week high-salt diet increased SBP gradually.SBP in the rats exposure to high salt for 16 weeks was significantly higher than that in control group (P＜0.05).After 4 weeks of eplerenone treatment，SBP in the rats was significantly lower than that before treatment (P＜0.05).Compared with control group，the aldosterone content in the aorta were significantly increased in high-salt diet group and eplerenone group (P＜0.05)，the expression level of MR also increased significantly (P＜0.05).Compared with control group，both eNOS protein expression (P＜0.05) and cNOS activity in high-salt diet group were significantly decreased (P＜0.05).The proteinbook=1607,ebook=79expression of eNOS as well as cNOS activity in aorta increased significantly in eplerenone group compared with high-salt diet group (P＜0.05).CONCLUSION: Aldosterone content in aorta of high-salt-induced hypertensive rats increases significantly.Aldosterone attenuates the protein expression of eNOS and reduces the enzyme activity through the activation of mineralocorticoid receptor.The selective mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone enhances the protein expression of eNOS and its activity，thereby improves eNOS function.

［KEY WORDS］Hypertension; High-salt diet; Endothelial nitric oxide synthase; Mineralocorticoid receptor

通讯作者△Tel: 0851-88416116; E-mail: dqlu91@hotmail.com

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.30871003) ;贵州省国际科技合作计划项目［黔科合外G字(2010) 7019号］

［收稿日期］2015-03-23

［文章编号］1000-4718(2015)09-1606-05

［中图分类号］R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.013