一种增强免疫力中药制剂的研发

贾福怀，陶 刚，吴国卿

(宁波御坊堂生物科技有限公司，浙江 宁波 315012)



一种增强免疫力中药制剂的研发

贾福怀，陶 刚*，吴国卿

(宁波御坊堂生物科技有限公司，浙江 宁波 315012)

目的：优化一种增强免疫力复方中药制剂的提取工艺，并对研制的复方中药制剂进行稳定性、安全性毒理学评价及功能性评价。方法：以粗多糖、总皂苷和淫羊藿苷含量为指标，以中药炙黄芪、淫羊藿、人参、熟地黄、茯苓、甘草为原料，应用正交实验法优化提取工艺，并对标志性成分的稳定性、灭菌工艺进行验证和评价，并依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》对研制的复方中药制剂进行安全性毒理学评价及功能评价。结果：最佳提取工艺条件为：初次提取按料液比1∶10煎煮2h，第2次提取按料液比1∶8煎煮1h。口服液中标志性成分均有较好的稳定性，在24个月保质期中可以保证产品质量的要求。灭菌条件的灭菌效果重现性很好，灭菌工艺条件稳定可靠。安全毒理学评价各项指标均未见明显毒性反应，功能评价为：受试样品高剂量组ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力和小鼠左后足跖部24h与0h厚度测量值差值均增加，差异均有显著性。 结论：建立的提取方法具有提取效率高、工艺简单等优点，经过安全性毒理学试验证明属于无毒性产品，经功能学试验证明具有增强免疫力的保健功能，长期食用可改善体质、增强免疫力。

复方中药制剂；增强免疫力；中药研制；稳定性、安全性；毒理学

现代社会，很多疾病发生的深层原因是免疫力低下或免疫力不健全。人体免疫系统完善，则机体和谐、健康；反之机体受损，表现为易感染或者易生病状态。“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”，正气就是指人体的抗病能力，也就是免疫力[1]，正气不足表现为虚症，注意保护免疫系统不受损害至关重要。

单一的药物只能控制或者缓解某些症状，很难彻底缓解免疫力低下的复杂身体状况，复方可以提高疗效，减少毒副作用。人体免疫系统存在着一定的动态平衡，许多中药对人体免疫力的调节有着先天优势。本中药制剂进行复方配伍时遵循“君臣佐使”这一重要原则，以炙黄芪和淫羊藿为君药，对增强免疫力起主要作用；辅以常用中药人参、茯苓，能够补气生血，增强机体免疫力，起到协调配合君药的疗效；人参和黄芪皆为重要的补气扶正药，两者合用旺气生血，可增强机体免疫调节功能[2]；同时熟地黄温和滋阴、益精填髓[3]，甘草缓和矫正阳性药物的火烈药性、解毒滋补。本复方可以缓和因人体衰老、生活工作压力过大等原因产生的免疫力下降等一系列身体状况，达到肝肾阴阳同补、固本扶元、祛邪调理的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料 炙黄芪、淫羊藿、人参、熟地黄、茯苓、甘草(安徽济人药业有限公司)；低聚果糖(量子高科(中国)生物股份有限公司)；山梨酸钾(罗盖特精细化工有限公司)。

1.1.2 设备 Agilent 1260高效液相色谱，数显恒温水浴锅，梅特勒-托利多pH计，电子分析天平，紫外可见分光光度计，阿贝折射仪，超声波清洗器，低速离心机，水浴检漏灭菌柜，高速管式离心机，自动锁口机，鼓风干燥箱，恒温恒湿箱，提取浓缩罐。

1.2 测定方法

感官：感官鉴定法；可溶性固形物：GB/T 12143；pH：《中华人民共和国药典》(2010年版)一部附录Ⅶ G；重金属、农药残留：GB 5009；粗多糖：硫酸苯酚法；总皂苷：《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)规定方法；淫羊藿苷：GB/T 22247；微生物指标：GB 4789；安全性毒理学试验、功能性实验：卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)[6]。

1.3 工艺流程

中药→切片→一次煎煮→过滤→二次煎煮→过滤→合并滤液→离心→浓缩→复配(低聚果糖、山梨酸钾、纯化水)→煮沸灭菌→冷却→灌装→锁口→热压灭菌→冷却→贴标→装盒→装箱。

1.4 制剂工艺要点

1.4.1 提取 中药炙黄芪、淫羊藿、人参、熟地黄、茯苓、甘草以3∶2∶1∶1∶1∶0.5的比例准确称量并作相应的切片处理，混合均匀后投入中药提取设备中加入总药重10倍量的纯化水，夹套中通入蒸汽加热，煎煮2h，过滤，得到第1次滤液和滤渣，滤渣继续加入总药重8倍量的纯化水煎煮1h，过滤，得到第2次滤液。

1.4.2 离心、浓缩 将2次滤液合并，经过高速管式离心机离心处理(15 000r/min，蠕动泵上料)去除沉淀，使用中药浓缩设备减压浓缩至相对密度1.12～1.14(真空度-0.08MPa)。

1.4.3 配料、灌装 浓缩液转移入配料罐中，加入占浓缩液总重量50%的低聚果糖糖浆、0.4%的山梨酸钾(用少量纯化水溶解)，250%的纯化水，配制成口服液，将该口服液煮沸20min，循环水冷却至室温，转移至灌装设备，使用钠钙玻璃瓶灌装至规定的装量，用铝制防盗盖自动锁口机锁口。

1.4.4 灭菌 采用真空检漏灭菌柜热压灭菌方式灭菌(工艺参数温度121℃，时间20min)，

1.4.5 成品 产品放冷后转入后续包装工序贴标、喷码、装盒、装箱即得成品入库。

1.5 口服液包装优点

本复方中药制剂考虑采用口服液的剂型，钠钙玻璃药瓶包装，铝制防盗盖密封，安全卫生，不会造成交叉污染、受潮结块等状况，更有以下优点：有效成分分散在介质中，分散度大、吸收快，能较迅速发挥作用；能减少成分的刺激性，生物利用度高；易于区分剂量，食用方便。

2 结果与分析

2.1 提取条件的确定

炙黄芪、人参、甘草、茯苓及熟地黄中均含多糖类成分，人参中含有大量的人参皂苷，淫羊藿主要含以淫羊藿苷为主的黄酮类成分，故确定本品的标志性成分为粗多糖、总皂苷和淫羊藿苷。多糖类是极性较大的成分，水和稀醇作为溶媒对多糖类的提取效果较好；总皂苷的提取方法[4]使用较多的是水提煎煮法和醇提回流法，煎煮法得到的浸膏量较多，各物质溶出效果好，而乙醇回流法提取皂苷率都在8%以上，皂苷含量高；淫羊藿苷根据其理化性质，用乙醇溶液作为提取溶媒能更多地提取出淫羊藿苷，这也与赵燕燕[5]报道的淫羊藿苷提取条件筛选正交试验设计结果，最佳提取工艺为20倍量，70%乙醇提取3次，每次0.5h相符，但是本品为复方制剂，各原料配伍后综合起效，所以提取条件不能简单地以淫羊藿苷提取量多少来确定。水提取法是既简单又经济的中药口服液提取方法，且也符合中药传统的食用方法(水煎煮法)，而醇提法会损失绝大部分有益的多糖成分，因此本产品采用传统的水提取法结合试验筛选，初步确定采用第1次加入10倍量水提取2h，第2次加入8倍量水提取1h，并对此条件进行了3次验证试验，具体操作：称取炙黄芪120g、淫羊藿80g、人参40g、熟地黄40g、茯苓40g、甘草20g共3份，分别加10倍、8倍量水提取2次，第1次提取2h，第2次提取1h，过滤，合并滤液，加热浓缩，复配成成品并测定粗多糖、总皂苷和淫羊藿苷的提取量，结果见表1。

经3批试验结果表明，传统水提法工艺稳定、可行，故确定提取工艺条件为：10倍量水提取2h，过滤；8倍量水提取1h，过滤；合并2次滤液。

表1 提取条件验证试验结果 (mg/100mL)

2.2 标志性成分的稳定性

对口服液产品在37℃和相对湿度75%的恒温恒湿箱中加速试验3个月，每月测定口服液中粗多糖、总皂苷、淫羊藿苷的含量，经过3个月的加速实验，标志性成分的变化趋势见图1、图2、图3。

图1 3个月加速试验中粗多糖含量变化

图2 3个月加速试验中总皂苷含量变化

图3 3个月加速试验中淫羊藿苷含量变化

本批次口服液经过3个月的加速试验，标志性成分含量都有所降低，其中粗多糖含量减少2.98%，总皂苷含量减少7.14%，淫羊藿苷含量减少2.93%，降幅不是很大，加速完成的产品中3项指标含量分别为912mg/100mL、117mg/100mL、9.95mg/100mL，仍高于指标要求，因此，该口服液中标志性成分均有较好的稳定性，在保质期24个月中可以保证产品质量。

2.3 灭菌工艺的验证

2.3.1 验证方法 使用121度压力蒸汽灭菌生物指示剂(型号ATCC7953，嗜热脂肪杆菌芽孢)嗜热脂肪杆菌芽胞嗜热脂肪杆菌芽胞做灭菌工艺验证。热压灭菌效果与灭菌时间、温度、产品装载密度等工艺条件有关，将灭菌时间设为10min、20min、30min，在水浴检漏灭菌柜内放置待灭菌产品，并在灭菌柜前后门处产品的上部、中部、下部各放置一支压力蒸汽灭菌生物指示剂，温度上升至T=121℃，工作压力P=150kPa、灭菌时间参考工艺参数，降温取出灭菌产品及生物指示剂，指示剂置于56～60℃培养箱中培养48h后取出观察颜色变化，另取一支未经灭菌的生物指示剂一起培养，作为阳性对照。

2.3.2 结果判断 在同一个灭菌器中采用不同的灭菌时间进行3次灭菌试验，灭菌时间分别为10min、20min、30min。根据56～60℃ 培养48h后生物指示剂颜色判断灭菌效果，培养后生物指示剂全部保持紫色则灭菌合格，如有一支由紫色变为黄色则为不合格，对照管由紫色变为黄色证明该指示剂有效。验证数据见表2。

表2 不同灭菌时间对灭菌效果的影响验证试验结果

2.3.3 结论 121℃、10min灭菌不合格，证明这个条件下灭菌仍有风险，不宜采用，20min和30min的灭菌参数条件下，灭菌都是合格的，考虑到生产实际情况和能源消耗，采用121℃、20min灭菌工艺参数，并作重现性试验验证此工艺参数。根据上述试验结论选择灭菌时间20min，重复3次灭菌过程，生物指示剂放置的位置同之前的验证要求一致，验证灭菌效果的重现性。结果3次灭菌的生物指示剂经56～60℃ 培养48h后，均未变色(保持紫色)，阳性对照管变黄色，证明此灭菌条件的灭菌效果重现性良好，灭菌工艺条件稳定可靠。

3 安全性毒理学评价及功能评价

检测依据：卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)[6]。

3.1 安全性毒理学评价

用本品口服液样品制作浓缩液(浓缩比例10∶1)，无菌包装，实验时以浓缩液原液作为受试物，以蒸馏水为溶媒将样品配制成不同浓度的样品液供试。

大小鼠急性经口毒性试验，选用SD大鼠和ICR小鼠，采用最大耐受剂量法，设样品40.0g/kg一个剂量组，经口灌胃方式给受试物，观察一般状况、中毒症状和死亡情况，观察期限为2周。染毒后，观察期内均未见大小鼠出现中毒和死亡状况，雌雄两性急性经口最大耐受剂量均大于40.0g/kg体重，属于无毒类。

用10倍浓缩液进行Ames试验，试验菌株选用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97 、TA98 、TA100 、TA102，结果为阴性，小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验，选用ICR小鼠，设样品5.0、10.0和20.0g/kg体重三个剂量组，结果均为阴性，表明本品无致突变特性。

大鼠30天喂养实验，试验样品为产品的10倍浓缩液，设三个剂量组及阴性对照组，分别相当于人推荐摄入量的25、50、100倍，实验时用蒸馏水稀释成不同剂量浓度供试，大鼠选用SD大鼠80只，随机分成四组，每组20只，雌雄各半。实验期间，各组大鼠均未见异常症状和体征，也无死亡，各剂量组各项指标均未见明显毒性反应，与阴性对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。

3.2 增强免疫力功能性试验评价

3.2.1 方法 供试样品为产品的10倍浓缩液，产品人推荐剂量为40mL/60kg/日，相当于产品的10倍浓缩液4mL/60kg/日。实验设三个剂量组和阴性对照组(蒸馏水)。低、中、高三个剂量为产品的10倍浓缩液0.33、0.67和2.0mL/kg体重，相当于人推荐量的5倍、10倍和30倍。实验用清洁级ICR小鼠，雌性，体重(20±2)g。连续30～35天经口给予不同剂量的受试样品，阴性对照组给予蒸馏水。

3.2.2 结果 与阴性对照组比较，受试样品低、中剂量组小鼠溶血空斑数均增加，差异均有显著性；与阴性对照组比较，受试样品中剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数均升高，差异均有显著性；与阴性对照组比较，受试样品高剂量组ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力和小鼠左后足跖部24h与0h厚度测量值差值均增加，差异均有显著性。说明本口服液具有增强免疫力的功能。

4 产品质量控制

该产品按照以下质量标准严格控制质量，保障产品品质。

4.1 感官评价

棕色至棕褐色液体，无肉眼可见外来杂质，允许有少量沉淀，味苦回甘，具有原料中药特有的气味。

4.2 微生物指标

菌落总数≤50cfu/mL，大肠菌群≤6MPN/100mL，霉菌和酵母均≤10cfu/mL，致病菌皆不得检出。

4.3 标志性成分指标

粗多糖含量(以葡萄糖计)≥800mg/100mL，总皂苷(以人参皂苷Re计)≥100mg/100mL，淫羊藿苷≥7.0mg/100mL。

4.4 理化指标

可溶性固形物≥12g/100mL，pH为3.5～5.0，铅含量(以Pb计)≤0.5mg/kg，砷含量(以As计)≤0.3mg/kg。

4.5 农药残留指标

六六六≤0.1mg/kg，滴滴涕≤0.1mg/kg。

5 讨论

现代生活节奏的加快使人们休息睡眠不足、超负荷工作、缺乏锻炼，使疲劳和免疫力下降，慢性疾病增多。要预防或减少免疫力低下导致的疾病，除了要增强自我保健意识、养成良好的生活习惯外，采取一定的干预措施十分必要。保健食品具有一定的保健功能，且安全性高、可长期服用，又可满足人们日常保健的需求，可大大增强早期预防的意义和价值。

本制剂是针对免疫力下降综合征，结合现代中药药理研究成果，以药食同源类或可用于保健食品的中药炙黄芪、淫羊藿、人参、熟地黄、茯苓、甘草等为主要原料经过提取浓缩、离心灭菌等工艺操作制成保健食品，经过安全性毒理学试验证明属于无毒性产品，经功能学试验证明具有增强免疫力的保健功能，长期食用可达到改善体质、增强免疫力的功效。

[1] 黄春丽，郑家铿.论虚实补泻与免疫[J].福建中医学院学报，1997,7(1):46-48.

[2] 方永顺，初杰.人参与黄芪配伍免疫作用的药理研究[J].中医药学刊，2002,20(4):471-476.

[3] 郑晓珂，侯委位，段鹏飞，等.熟地黄提取物体外免疫调节作用实验研究[J].中国药学杂志，2012,47(24):1995-2000.

[4] 张崇禧，郑友兰，张春红，等.不同方法提取人参总皂苷工艺的优化研究[J].人参研究，2003(4):5-8.

[5] 赵燕燕，徐本明，姜斌，等.淫羊藿总黄酮提取工艺对总黄酮和淫羊藿苷含量的影响[J].烟台大学学报:自然科学与工程版，2007,20(1):22-25.

[6] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[Z].2003.

(责任编辑：宋勇刚)

2014-12-05

贾福怀(1963—)，男，宁波御坊堂生物科技有限公司高级工程师，研究方向为健康产品开发。

陶刚(1984—)，男，宁波御坊堂生物科技有限公司工程师，研究方向为保健功能食品研发。

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1673-2197(2015)07-0021-03

10.11954/ytctyy.201507011