低氧诱导神经元特异性表达bFGF重组腺相关病毒载体构建研究

钱周敏

(温州医科大学仁济学院，浙江 温州 325035)



低氧诱导神经元特异性表达bFGF重组腺相关病毒载体构建研究

钱周敏

(温州医科大学仁济学院，浙江 温州 325035)

目的：研究构建低氧诱导神经元特异性表达碱性纤维细胞生长因子(bFGF)重组腺相关病毒载体。方法：以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为治疗靶基因，通过分子克隆手段，构建低氧诱导、神经元特异性表达bFGF的“时空”表达可调控性新型重组腺相关病毒(AAV)载体。结果：将重组质粒5HRE-3NRSE-bFGF的菌液送测序，得到测序结果，并与合成的DNA寡核苷酸序列进行比较，证实与设计序列完全一致。结论：构建、包装重组腺相关病毒载体pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF有效。

青光眼；低氧诱导；神经元特异性；腺相关病毒(AAV)载体

青光眼是人类的第二大致盲疾病，机械压迫和缺血缺氧所致的视网膜神经节细胞凋亡是该病致盲的主要原因。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)来源于中胚层和神经外胚层多种类型细胞，在脑和视网膜的发育及神经损伤修复过程中发挥重要作用。导师长期从事生长因子与创伤修复的基础理论、临床应用及其相关基因工程药物方面研究，结果显示bFGF具有神经保护与促进神经细胞轴突再生作用。bFGF为生物大分子，体外重组bFGF蛋白全身给药难以透过血眼屏障发挥治疗作用，若玻璃体腔内局部给药，由于半衰期短则需反复注射，易导致眼内炎症的发生，基因治疗因可维持长时间的bFGF基因表达，是青光眼等慢性神经变性疾病治疗的理想选择。

1 材料与方法

1.1 技术路线

本研究采用AAV Helper-Free System(Stratagene)构建2型重组腺相关病毒载体，与传统腺相关病毒载体构建方法比较，不存在辅助病毒的污染，并有效避免复制型腺相关病毒的产生，使用安全、高效。

①设计引物，分别以质粒pCMV6-XL4/bFGF为模板，PCR扩增目的基因bFGF；②通过基因重组手段，将bFGF插入质粒pCMV-MCS多克隆位点EcoRI/HindIII之间，重组质粒分别命名为pCMV-bFGF；③设计引物，以质粒pShuttle-5HRE-3NRSE-Luc为模板，PCR扩增基因表达调控序列5HRE-3NRSE；④设计引物，以pCMV-bFGF模板，PCR扩增目的基因序列Intron-bFGF-polyA；⑤设计引物，将5HRE-3NRSE与Intron-bFGF-polyA配对，通过重叠PCR手段扩增基因序列5HRE-3NRSE-Intron-bFGF-polyA；⑥所扩增的基因序列5HRE-3NRSE-Intron-bFGF-polyA经NotI酶切后，分别连接入质粒pAAV-MCS，所构建的重组质粒命名为pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF；⑦无内毒素质粒提取试剂盒中量制备所构建的重组腺相关病毒载体质粒pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF，及重组腺相关病毒包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper。见图1。

图1 重组腺病毒载体质粒构建

1.2 材料

1.2.1 主要仪器 普通电冰箱(上海),高速冷冻离心机(Hitachi CR 2082，Japan),普通台式高速离心机(上海),涡悬振荡器(QL.866，海门市其林贝尔仪器制造有限公司),PCR扩增仪(9600型，PE公司，U.S.A),水平离心机(上海安亭科学仪器厂),稳压稳流电泳仪(DYY.IIl2型，北京六一仪器厂),细菌培养箱(PYX.DHS.35×40，上海医疗器械七厂),超净工作台(苏净集团安泰公司)。

电子分析天秤(上海第二天平仪器制造厂),微量移液器(1000la l，20011 1，100μL，2-20la 1，0.5～10μL，Germany),普通枪头(广州威佳科技有限公司)。

1.2.2 菌株与质粒 菌株为大肠杆菌DH5 a，温州医学院中试基地提供。

质粒pENTR-D-TOPO-bFGF-IRES-hrGFP，由温州医学院中试基地提供,腺相关病毒所需的AAV Helper-Free System(Stratagene)由浙江省生物技术制药工程重点实验室提供。

1.2.3 主要试剂及试剂配制 75%乙醇(无水乙醇，国产分析纯试剂),RT-PCR试剂盒(TaKaRaPrimeScriptTM RT-PCR Kit Cat：DRR014A),PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成),1×TBE电泳缓冲液,10×Loading buffer(0．25%溴酚兰，0．25%-"甲苯青FF，40%蔗糖水溶液),DNA Marker(TaKaRa宝生物工程有限公司),DNA片段凝胶回收试剂盒(TaKaRa，DV805A)。

LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g加入800mL灭菌水，充分溶解，加NaOH调节pH值至7.0，加灭菌水定容至1L，高压灭菌后，40℃保存。

2 结果

酶切鉴定pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF：将菌种接种于LB液体培养基内，摇菌过夜，次日提取质粒，并纯化。电泳结果，与预期结果一样。见图2。

图2 pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF酶切鉴定——10000maker

3 讨论

基因治疗防治青光眼具有广泛的应用前景,但临床应用尚需进一步研究。理想基因治疗将遗传物质100%转移，并定点整合到细胞基因组中，在细胞中长期、特异地表达并按特定要求受到控制,但目前基因转移难以满足要求。眼科应用还要解决眼部的特异性及避免全身副作用等问题。探索理想基因转移方法,解决基因转移效率,提高基因表达水平及持续性,可成功转移基因治疗疾病。随着基因治疗基础研究的发展, 基因治疗必将应用于眼科疾病,并为青光眼的治疗提供全新手段。

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(责任编辑：李岚春)

2014-11-24

浙江省大学生科技创新活动计划创新项目(新苗人才计划)“低氧诱导神经元特异性表达bFGF重组腺相关病毒载体的构建”(2012R413023)

钱周敏(1991-)，男，温州医科大学仁济学院在读生，研究方向为中药学。

R741

A

1673-2197(2015)06-0005-02

10.11954/ytctyy.201506002