基于5-LOX体外代谢途径的火绒草抗炎活性部位筛选

姜 鸿，邹桂欣，王光涵，邸子真，尤献民

(辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034)



基于5-LOX体外代谢途径的火绒草抗炎活性部位筛选

姜 鸿，邹桂欣，王光涵，邸子真，尤献民*

(辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034)

目的：筛选火绒草中的抗炎活性部位。方法：采用系统溶剂法按照极性由低到高的顺序分离得到火绒草石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇萃取物、水提取物。采用酶联免疫法(ELISA)建立花生四烯酸(AA)的5-脂氧合酶(5-LOX)体外代谢途径，检测火绒草提取物抑制5-LOX活性的能力。结果：火绒草乙酸乙酯提取物对5-LOX活性有76.92%强度的抑制作用。结论：火绒草乙酸乙酯提取物具有较强的抗炎活性，可作为潜在的抗炎活性成分筛选药物。

火绒草；抗炎；酶联免疫法；花生四烯酸；脂氧合酶

火绒草(Leontopodiumleontopodioides(Willd.)Beauv为菊科火绒草属植物的干燥全草，其味微苦，性寒，入肾、膀胱二经，具有清热凉血、消炎利尿的功效。火绒草常用于治疗炎症性疾病，对于流行性感冒、急慢性肾炎、尿路感染、尿血、创伤出血等菌有一定的治疗效果。目前关于火绒草的文献报道较多，但对其活性部位的筛选研究尚未有文献报道。

炎症引发的疾病是人类常见的免疫系统疾病，医药市场对抗炎药物的需求量极大。药理学研究表明，花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，即5,8,11,14二十碳四烯酸，是生物体内必需的一种不饱和脂肪酸，在炎症发生过程中起着重要作用。在正常生理状态下，AA在生物体内主要以磷脂的形式存在于细胞膜上，当细胞膜受到各种刺激，特别是炎症反应发生时，在磷脂酶A(phospholipase A2，PLA2)和磷脂酶C(phospholipase C，PLC)的催化下，磷脂从细胞膜的磷脂池中释放出来，并在花生四烯酸代谢酶的作用下转变为具有生物活性的代谢产物，进而发生花生四烯酸的炎症级联代谢。目前研究表明，至少有环氧化酶(cycloxygenase，COX)、脂氧合酶(1ipoxygenase，LOX)和细胞素P450(cytochrome P450，CYP450)三类酶参与了AA代谢途径，主要的代谢通路为COX和LOX。LOX通路中至少有5-LOX、12-LOX和15-LOX 三种酶参与了AA代谢。其中，5-LOX在激活蛋白(5-FLAP)的协助下催化AA转化生成白三烯(1eukotrienes，LTs) 、脂质过氧化物，如在中性粒细胞和其他炎症细胞中，LTA4由环氧化物水解酶(LTA4H)催化生成LTB4；LTA4与谷胱甘肽结合转化为LTC4，而LTC4转运至细胞外并裂解形成LTD4和LTE4。形成白三烯的5-LOX通路在前炎症级联反应中起到重要作用，其中5-LOX、LTs、脂质过氧化物等分别是抗炎药物设计的重点靶标。

本研究采用酶联免疫法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)，借助AA的LOX体外生化代谢途径，筛选火绒草的抗炎活性部位，现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 药品

火绒草药材提取物，由本实验室提供。

1.2 试剂

Tris-HCl(Trizma Pre-set crystals pH7.0-biotechn,Lot No:11M5401)，5-LOX(Lipoxidase Type V from soybean,Lot No:91K7026V)，AA (Arachidnic ACID free ACID from porcine,Lot No:31M1213V)，HRP(Peroxidase Type VI-1 from horseradish*PA,Lot No:90M77151V)，以上试剂均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；TMPD(N,N,N’,N’-Tetramethy-p-phenylenediamine dihydrochloride，Johnson Matthey Company,Lot No:10119382)；二甲基亚砜(DMSO，色谱级)，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器

Biotek酶联免疫检测仪(Elx800型，美国伯腾仪器有限公司)；DHZ-D冷冻恒温震荡器(江苏太仓市试验设备厂)；QL-901漩涡振荡器(江苏海门麒麟仪器厂)；96孔板(美国Comning公司)。

2 方法

2.1 提取物制备

取火绒草药材适量，加水提取，量取1/2提取液，减压干燥至干，称定重量，粉碎成细粉，作为Ⅰ号提取物(火绒草药材提取液)；剩余提取液置于分液漏斗中，分别用石油醚、醋酸乙酯、水饱和正丁醇各萃取5次，分别合并各自萃取溶液，回收溶剂，减压干燥至干，称定重量，粉碎成细粉，分别作为Ⅱ号提取物(石油醚层)、Ⅲ号提取物(醋酸乙酯层)、Ⅳ号提取物(正丁醇层)。取经过上述溶剂萃取后的水溶液，浓缩并减压干燥至干，称定重量，粉碎成细粉，作为Ⅴ号提取物(剩余水层)。

2.2 方法

2.2.1 原理 花生四烯酸(AA)可被脂氧合酶(5-LOX)催化氧化生成5-羟基过氧四烯酸，辣根过氧化酶(HRP)可以5-羟基过氧四烯酸和四甲基对苯二胺盐酸(TMPD)为底物生成一种可在610nm处产生吸收的物质。

2.2.2 试剂配制 Tris-HCl：0.1mol·L-1，pH7.0；5-LOX：用前将其稀释至360μL，每次用量10μL，使其终浓度为1μg/孔；AA：采用95%乙醇将原液配置成浓度为21mmol·L-1的储备液，用时稀释30倍，每次用10μL，终浓度为33.33μmol·L-1；HRP：配置13.9mg/mL储备液，置于低温下保存，用时稀释20倍；TMPD：配制成28mg/mL储备液，置于低温下保存，用时蒸馏水稀释10倍。样品制备：将提取物溶解于DMSO中，制备成含200mg/mL生药的储备液。

2.2.3 操作步骤 ①空白：180μL Tris-HCl、10μLHPR；②控制池：170μL Tris-HCl、10μL 5-LOX、10μLHPR；③N：160μL Tris-HCl、10μL待测药物、10μL 5-LOX、10μLHPR；④小心振摇酶标板使溶液混匀，37℃孵育10min；⑤每个池加入10μL TMPD，再加入10μL花生四烯酸以激活反应，小心振摇酶标板数秒钟使溶液混匀，在25℃下孵育15min。采用酶标仪于610nm波长处测定吸光度，以上试验重复操作5次，计算吸光度平均值。

3 结果

从表1结果可以看出，Ⅲ号提取物抑制了76.92% 5-LOX的活性，为5个提取物中5-LOX活性抑制作用最强的，其次为Ⅰ号提取物(57.69%)和Ⅳ号提取物(43.85%)，Ⅱ号提取物对5-LOX的抑制作用很弱(15.38%)，Ⅴ号提取物对5-LOX几乎没有抑制作用。由此可知，火绒草中具有抗炎作用的部位主要为Ⅲ号提取物，即乙酸乙酯提取物；Ⅰ号提取物(火绒草药材提取液)的抗炎作用次于Ⅲ号提取物，可能是由于Ⅰ号提取物是火绒草药材原提取液，所含成分复杂，一些杂质成分干扰活性成分的抗炎效果；Ⅳ号提取物，即正丁醇提取物，也有一定的抗炎作用，仅次于Ⅰ号提取物，说明Ⅳ号提取物中也可能含有一些具有抗炎活性的成分，或者这些成分是和Ⅲ号提取物共有的。基于以上结果，笔者将进一步对Ⅲ号、Ⅳ号提取物进行研究，寻找火绒草药材中具有抗炎活性的单体化合物。

表1 样品吸收度及相对酶活力 ±s)

4 讨论

4.1 DMSO对实验结果的影响

由于火绒草提取物中含有脂溶性和水溶性两种成分，为使提取物完全溶解，故采用DMSO作为溶媒，并分别配制含有不同浓度的DMSO缓冲液，按相同的实验方法进行测定。结果显示，DMSO浓度对测定结果的影响很小，各组间比较无显著差异，但为使实验结果更加科学、真实，实验中应使DMSO浓度保持一致。

4.2 测定时间对实验结果的影响

TMPD易被氧化，其水溶液在空气中就可被缓慢氧化成蓝色，蓝色的深浅程度与所检测的酶活性具有良好的线性关系，因此可用于检测抑制剂的活性。但空气中也可能含有具有一定氧化能力的物质，因此确定最佳测定时间点为本实验的关键。本研究按照上述测定方法，在0～60min内动态考察样品与纯TMPD吸收度在不同时间段的比值，以此确定其最终测定时间。本实验结果表明，在15min时两者的比值最大，因此确定最佳测定时间为15min。

4.3 测定样品终浓度对实验结果的影响

测定样品终浓度对测定结果影响很大，当样品溶液终浓度过高时，反应体系颜色明显变浅，但吸光度值很大，甚至超过控制池的限值，会造成样品几乎没有抑制5-LOX活性作用的假象，且每次实验结果的重复性很差。通过对样品系列浓度考察发现，以提取物中对5-LOX活性抑制作用最强的Ⅲ号提取物为准，样品最佳终浓度为200mg/mL，每次加10μL，测定结果重复性较好，5个提取物的变异系数在1.06%～1.82%之间(n=5)，实验重复性良好。

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(责任编辑：尹晨茹)

Leontopodium Anti-inflammatory Active Site Selection Based on 5-LOX in Vitro Metabolic Pathways

Jiang Hong,Zou Guixin,Wang Guanghan,Di Zizhen,You Xianmin*

(Medical Research Institute of Liaoning Province,Shenyang 110034,China)

Objective:To filtrate anti-inflammatory active site of leontopodium.Methods:The system solvent method is adopted according to the polarity from low to high,the leontopodium petroleum ether extract and ethyl acetate extract,n-butanol extract and water extract was isolated.Using ELISA,to establish the AA of 5-LOX in vitro metabolic pathways,detect leontopodium extracts inhibit the ability of 5-LOX activity.Results:The Ethyl acetate extract of leontopodium inhibits the 76.92% activity of 5-LOX.Conclusion:The ethyl acetate extract of the leontopodium has strong anti-inflammatory activity.

Leontopodium；Anti-inflammation；ELISA;Arachidonic Acid；Lipoxygenase

2014-10-29

国家科技重大专项：中药新药临床评价研究技术平台(2012ZX09303-017-001)

姜鸿(1975-)，男，辽宁省中医药研究院副研究员，研究方向为中药药效物质基础及中药新药研发。E-mail：jh0723@126.com

尤献民(1964-)，男，辽宁省中医药研究院研究员，硕士生导师，研究方向为药物分析及中药新药研发。E-mail：youxianmin1120@126.com

R285.5

A

1673-2197(2015)06-0036-02

10.11954/ytctyy.201506016