酒曲中产酯酵母的分离筛选

万世旅，李光辉，钟姝霞，边名鸿

(1.四川理工学院生物工程学院，四川 自贡 643000;2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 自贡 643000)

引言

产酯酵母又称生香酵母，是可生成较多酯类物质的酵母通称，分属于汉逊酵母属，产朊酵母属、假丝酵母属、球拟酵母属和酒香酵母属等，是中国白酒中酯香的主要产生菌。产酯酵母主产乙酸酯类，特别是乙酸乙酯［1-3］。

小曲酒是我国白酒的主要酒种之一，在四川、贵州、云南、江西、湖北和湖南等省有广泛的分布。随着小曲白酒生产工艺技术的改革和科研的进步，小曲酒的质量有了一定提高，但仍普遍存在放香不足等问题［4］。乙酸乙酯作为小曲白酒的主体香味成分，其含量对于小曲酒的质量有着重要影响，因此，筛选产乙酸乙酯能力强，产酯丰富并且适合小曲酒生产的酵母，可以为小曲的制曲提供优良的菌种，提高小曲质量，改善小曲酒酒质，促进小曲酒的发展，同时提高小曲酒生产企业的经济效益和市场竞争力［5］。

传统酒曲中含有大量酿酒有益微生物，包括优良糖化菌、酵母菌等，本文从优质酿造酒曲中筛选产酯酵母，并以高粱酶解液作为培养基研究其产酯情况，以期获得适于小曲酒酿造的优良产酯酵母。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品及菌种来源

样品:8种来源于川西南片区不同区域的酿造酒曲，其中，5种大曲，3种小曲。

对比菌株:产酯酵母Njsys-SYT由实验室分离培养并保存。

1.1.2 主要试剂

氢氧化钠、醋酸钠、氯化钾、硫酸、无水乙醇、酚酞、氯化钠、葡萄糖、琼脂粉(分析纯，成都科龙化工);糖化酶、淀粉酶、蛋白胨、酵母浸膏(北京奥博星生物技术有限责任公司);三丁酸甘油酯(阿拉丁试剂(上海)有限公司);链霉素、青霉素、土豆、高粱(市售)。

1.1.3 培养基

产香初筛培养基:马铃薯20%，蔗糖2%，琼脂2%，三丁酸甘油酯0.4%，pH自然(涂布时培养基中加入60 mg/L的青霉素抑制细菌生长，在温度40℃左右时，添加摇匀)。

菌种活化培养基:葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，pH自然。

发酵产酯培养基［6］:取150 g高粱粉于2 L烧杯中，加入少量自来水，搅成糊状，再加热水600 mL，搅匀，调pH值为6.0～6.5，加入α-淀粉酶和糖化酶经液化和糖化后取上清液将其糖度调到8°Bx备用。

1.1.4 主要仪器

E100生物显微成像系统(日本NIKON公司)，UV-200紫外可见分光光度计(上海尤尼柯有限公司)，PHJ-02型pH计(上海精密科学仪器有限公司)，BS-2F数控恒温摇床培养箱(常州精成国华仪器有限公司)，MJ-250生化培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母的分离纯化

称取5 g酒曲样品，加入装有45 mL无菌生理盐水的三角瓶中，150 r/min振荡30min，充分摇匀。取5 mL上清液加入45 mL麦氏培养液三角瓶中30℃摇床富集培养24 h，经梯度稀释后涂布，依次挑取有透明圈的单菌落，经多次平板划线纯化后，通过显微镜观察是否为纯种菌落，将纯菌种移入试管斜面，冰箱内保存备用;不纯的继续分离划线，直至纯化为止。

1.2.2 产酯酵母初筛

将从曲样中分离得到的产酯酵母菌和对比菌株Njsys-SYT采用点种的方式接种到产香初筛培养基上，30℃培养48 h，每株菌设计3个平行对照组，测量菌落直径d，透明圈直径D，计算D/d值，选择D/d值较大的作为复筛出发菌株。

1.2.3 产酯酵母复筛

对复筛菌株进行活化，接种在液体活化培养基中，摇床培养24 h后，将细胞数稀释到108个/mL，按10%的量接种于装有100 mL发酵产酯培养基的三角瓶中，28℃恒温静置培养4 d，每株菌设计3个平行对照组，检测总酯含量，总酯的测定采用皂化回流法［7］。同时将这几株菌制作成纯种酵母曲测定其对四大酯催化生产能力:称取相当于5 g干曲的曲量加入100 mL含1%相应有机酸和20%乙醇的酯化体系中32℃酯化100 h，加水50 mL蒸馏，接溜出液100 mL测定相应酯含量［8］。

1.2.4 产酯酵母的耐受性研究

耐酒精试验:在酒精浓度为0%，6%，8%，10%，12%，14%的YEPD液体培养基中接入菌种，120 rpm摇床培养24 h后测定600 nm波长下的吸光值，浓度大的菌液可以作适当稀释，使其测得OD值在0.10～0.80以内，经稀释后测得的OD值乘以稀释倍数，即为培养液实际的 OD 值［9］。

耐热试验:分别将接有菌种的培养基置于30℃、34℃、36℃、38℃和40℃下120 rpm振荡培养24 h后，测定600 nm波长下的OD值。

耐酸性试验:用盐酸调节培养基 pH 为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，接入酵母菌悬液，30 ℃、120 rpm 摇床培养24 h后，测定600 nm波长下的OD值。

2 结果与分析

2.1 酵母的分离纯化

采用传统分离手段对酒曲中酵母菌进行分离，将富集后的酒曲菌悬液经过涂布、划线后共分离出31株酵母菌株，其中有透明圈的产酯酵母有18株，菌落大多呈乳白色，表面较湿润粗糙，中央平坦边缘整齐，细胞多呈圆形。透明圈明显的代表性菌株如图1所示。

图1 部分菌落与菌体形态

2.2 产酯酵母的初筛

将从曲样中分离得到的18株产酯酵母及对比菌株Njsys-SYT接入产香初筛培养基上。通过测量酵母菌落直径d、透明圈直径D，计算其比值D/d，通过D/d值的大小来表征酵母菌酯化酶活力的高低，结果如图2所示。

对比菌株Njsys-SYT是实验室保存的一株优良产酯酵母菌，因此考虑以Njsys-SYT为参考，选择D/d≥3.0作为复筛条件，由图 2可知，Y1、Y2、Y4及 Y6的D/d值均大于3.0，因此选择这4株菌作为复筛出发菌株，进一步研究其产酯化酶能力。

2.3 产酯酵母的复筛

将 Y1、Y2、Y4、Y6 及 Njsys-SYT 5 株菌株进行发酵，测定其总酯含量，并将其制作成纯种酵母曲考察其对己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯的催化生成能力。结果分别如图3和图4所示。

图3 复筛酵母的产总酯结果比较

图4 复筛酵母的四大酯催化生成能力比较

从图3中可知，在相同的条件下，酵母Y2、Y4和Njsys-SYT产酯效果较好，其中酵母Y2产酯能力突出，发酵液中总酯含量达到3.273 g/L，酵母Y4和Njsys-SYT的发酵液中总酯含量分别也达到2.042 g/L和2.129 g/L。

由图4可知，5株酵母均对乙酸乙酯有很高的催化生产能力，其次是己酸乙酯，其中酵母Y2对这两种酯的催化能力最强，其催化生成乙酸乙酯和己酸乙酯的量达到2.731 g/L和1.921 g/L;5株酵母对己酸的催化能力高于对乳酸的催化能力，这与产酯酵母有升己酸乙酯，降乳酸乙酯作用的研究报道相符［10］。综上分析，酵母Y2在液态和固态发酵下都有较强的酯化能力，可作为一株优良的产酯酵母。

2.4 产酯酵母生长特性研究

小曲酒酿造环境(高酒精浓度、低pH及高温)对产酯酵母影响较大，因此需要研究产酯酵母在不同条件的生长情况，以考察菌种对酒精、温度及酸度的耐受性。

2.4.1 酒精浓度对菌株生长的影响

将酵母菌悬液接种于酒精含量分别为0%，6%、8%、10%、12%、14%的YEPD液体培养基中30℃培养24 h后，测定其在600 nm的菌体浓度，结果如图5所示。

图5 不同酒精含量下Y2菌株的生长情况

由图5可以看出菌株的生长随着酒精浓度的升高而受到严重影响。菌株Y2能耐受10%的酒精环境，有较高的耐酒精能力，这样在白酒发酵后期，酒精的积累对菌株Y2的影响相对会较小，有利于香味物质的合成。

2.4.2 耐热性试验

将酵母菌悬液接种于YEPD液体培养基中，分别置于30℃，34℃，36℃，38℃，40℃下120 rpm振荡培养24 h后，测定其在600 nm波长下的菌体浓度，结果如图6所示。

图6 不同温度下Y2菌株的生长情况

小曲白酒因为发酵周期短，因此在发酵过程中升温幅度较大。耐高温的产香微生物有利于代谢产物的积累，同时，温度影响微生物细胞内生物大分子(如蛋白质和核酸)的稳定性、细胞膜的流动性等方面［11］，温度变化能够导致细胞膜破坏、代谢活动减弱，影响细胞生长。由图6可知，菌株Y2在38℃仍有一定的生长，有较强的耐热性。

2.4.3 耐酸性试验

将酵母菌悬液接种于 pH 值分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的YEPD液体培养基中30℃培养24 h后，测定其在600 nm的菌体浓度，结果如图7所示。

图7 不同pH条件下Y2菌株的生长情况

小曲酒发酵周期短，产酸快，酿酒过程pH值较低，因此对微生物耐酸性要求很高。同时pH值变化能使微生物细胞中的电解质发生变化，从而影响微生物的生长代谢［12］。由图7可知，Y2酵母菌株在pH值为2的情况下生长依然旺盛，可见该菌株耐酸性能很好。

3 结束语

本文从不同酒曲样品中分离纯化出有产酯能力的酵母菌18株，通过初筛、复筛，得到一株产乙酸乙酯能力较强的酵母 Y2，其在高粱糖化液中总酯产量为3.273 g/L，在100 mL的酯化体系中催化生成乙酸乙酯和己酸乙酯的量为2.731 g/L和1.921 g/L。该酵母菌能在酒精浓度10%、pH2.0、温度为38℃的条件下生长，具有良好的耐酒精、耐酸和耐热能力，是一株优良的产香酵母，在改善小曲酒风味及稳定酒的质量有较好的应用前景。

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