链格孢属小孢子种总DNA提取方法的比较

刘振亚 熊仁次 朱天生

(塔里木大学植物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)



链格孢属小孢子种总DNA提取方法的比较

刘振亚 熊仁次 朱天生*

(塔里木大学植物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)

本研究采用液氮研磨法和石英砂研磨法对链格孢属小孢子种总DNA进行提取，并通过超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度及通过琼脂糖凝胶电泳和PCR检测DNA的质量，以期筛选出适合链格孢属小孢子种总DNA提取的方法。结果表明，两种方法均可得到链格孢属小孢子种的DNA，并且两种方法提取基因组DNA的效果无明显的区别。其中，液氮研磨法需要较多的菌丝体、所需时间长、成本高、获取液氮不易，而石英砂研磨法简单快速、时间短、成本低、研磨充分，损失少、可以避免使用液氮等优点。因此，石英砂研磨法是链格孢属小孢子种用于病原种类研究所需总DNA提取的较为理想的方法。

链格孢属小孢子种； DNA提取； 石英砂研磨法； 液氮研磨法

枣属鼠李科(Rhamnaceae)枣属(ZizyphusMill.)植物[1]，枣树对气候、土壤的适应能力很强，耐土壤干旱、盐碱和贫瘠，已成为新疆南疆各地防风固沙的经济林树种，而红枣产业已成为南疆特色支柱产业，带动了当地的就业和经济发展，将进一步改善边疆社会稳定现状。近几年随着红枣进入丰产期，与Alternariaspp.有关的枣果黑斑病、缩果病等链格孢属小孢子种引起的病害发生越来越严重，造成了较大的经济损失，而目前有关这些病害的报道中病原种类较为混乱和不确定，给该类病害的防治工作带来一定的困难。本研究拟对南疆地区密植枣园的枣果和枣叶上的病原菌通过形态学鉴定结合分子鉴定的方法进行准确鉴定，而链格孢属小孢子种DNA的提取是本研究的前提，因此筛选出高效快速的DNA提取方法，对链格孢属病原菌的准确鉴定具有重要的意义。目前报道中多采用CTAB法提取链格孢属病原菌的DNA，于丽娜[2]用CTAB法提取冬枣黑点病病原菌的DNA,经PCR扩增，通过ITS基因序列分析结合形态学鉴定，确定冬枣黑点病病原菌为Alternariaalternata(Fr.)Keissler。于占晶[3]等用CTAB法提取壶瓶枣褐斑病病原菌的DNA，采用通用引物ITS1和ITS4、特异性引物AAF2和AAR2以及Aalt-F和Aalt-R进行PCR扩增，通过三个基因序列分析结合形态学鉴定，确定壶瓶枣褐斑病的病原菌为A.alternata(Fr.)Keissler。王志霞[4]用CTAB法获取红枣叶斑病病原菌的DNA，使用病原菌的rDNA-ITS、EF1-α、β-tubulin基因进行PCR扩增，通过三个基因序列分析结合形态学鉴定，确定红枣叶斑病的病原菌为A.alternata(Fr.)Keissler、Fusariumoxysporum(Schlecht.) 和F.equiseti。袁洪水[5]在提取顶头孢霉DNA时发现，使用液氮研磨法，研磨强度不够时，不利于染色体DNA的充分释放,但研磨过于激烈会导致染色体DNA的断裂，而石英砂研磨法提取DNA是利用石英砂为介质对真菌细胞进行研磨破壁,能使染色体DNA充分释放,又可以通过控制研磨时间及研磨力度确保染色体DNA的完整性。目前还没有关于使用石英砂研磨法提取链格孢属小孢子种总DNA的报道。因此，本研究采用液氮研磨法和石英砂研磨法2种方法，对6种链格孢属小孢子种进行DNA提取比较研究，并采用通用引物和特异性引物对提取的DNA进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增检测DNA的质量，筛选出适合链格孢属小孢子种总DNA提取的方法，为链格孢属病原菌的准确鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种的培养和收集

实验所用的6种链格孢属小孢子种由本实验室(塔里木大学南疆农业有害生物综合治理重点实验室)分离、纯化并保存。

将菌株接种到PDA培养基上，28℃培养5天，使用打孔器打取菌饼转接到含有100mLPD的锥形瓶中，置于28℃、转速为180r/min的摇床中，培养2-3天后，用无菌水冲洗，四层灭菌的纱布过滤，40℃烘干后放入灭菌EP管中备用。

表1 链格孢属小孢子种编号

1.2 DNA提取方法

1.2.1 液氮研磨法

参照刘娟[6]的方法，并略做改进。称取0. 2g的菌丝体加入液氮快速研磨成粉后，装入离心管中，加入600μL预热1h的CTAB,充分混匀，65 ℃水浴1h，在水浴期间，每隔15min轻摇一次，加入等体积的酚：氯仿：异丙醇(25:24:1)，轻摇10min，8 000rpm离心10min,取上清液，加入等体积的氯仿：异丙醇(24:1), 轻摇10min，13 000rpm离心10min后，取上清液，加入0. 1倍的3mol/L醋酸钠和等体积的异丙醇(醋酸钠和异丙醇提前放在-20 ℃冰箱中预冷)，小心的反转离心管将液体混合均匀后，置-20 ℃冰箱中沉淀2h，13 000rpm离心5min，收集沉淀，用500μL冷冻的70%的酒精洗涤沉淀2次，无水乙醇冲洗1次，最后在室温条件下干燥，在无水乙醇挥发干净后，向离心管中加入100μLTE(PH8. 0),4 ℃放置过夜，使DNA充分溶解，待DNA充分溶解后，向其中加入1μL10mg/mLRNase，37 ℃水浴2h[7]，使RNA完全降解。

1.2.2 石英砂研磨法

参照夏花[8]的方法，并做改进。称取0. 1g的菌丝体，加入一定量的CTAB和适量的石英砂研磨充分，取研磨液于1. 5mL的离心管中，65 ℃水浴20min，加入600μL7. 5mol/LNaCl溶液，充分混匀后，冰浴10min，13 000rpm离心5min，取上清液到新的离心管中，加入等体积的氯仿：异丙醇(24:1), 轻摇10min，13 000rpm离心5min后，加入加入0. 1倍的3mol/L醋酸钠和2倍体积的无水乙醇(醋酸钠和无水乙醇提前放在-20 ℃冰箱中预冷)，13 000rpm离心5min，收集沉淀，用500μL冷冻的70%的酒精洗涤沉淀2次，待乙醇挥发后，向离心管中加入100μLTE(PH8. 0),4 ℃放置过夜，使DNA充分溶解，待DNA充分溶解后，向其中加入1μL10mg/mLRNase，37 ℃水浴2h，使RNA完全降解。

1.3 DNA质量检测

1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

取3μL的DNA样品与6μL6×LoadingBuffer混合均匀后上样，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,电泳缓冲液为1×TAE,恒定电压为80V，电泳为30min，电泳结束后，在紫外凝胶成像仪上观察并照相。

1.3.2 超微量分光光度计检测DNA质量测定

使用NanoDrop2000超微量分光光度计检测基因组DNA的纯度和浓度。

1.3.3PCR检测

基因组DNA-ITS的PCR检测：真菌的通用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’,ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反应体系25μL[9]：10×PCR反应缓冲液2. 5μL、MgCl2(25mmol/L)1. 5μL、dNTPs(10mmol/L)0. 2μL、ITS1(10μmol/L)1μL、ITS4(10μmol/L)1μL、Taq酶(5u/μL)0. 125μL、模板DNA1μL。扩增程序:94 ℃预变性2min，94 ℃1min,55 ℃30s,72 ℃1min，35个循环，72 ℃延伸10min。

基因组DNA-ATP的PCR检测：真菌特异性引物由上海生工生物工程股份有限公司合成ATPDF1:5’-ATCGTCTCCATGACCGAGTTCG-3’,ATPDR1:5’-TCCGATGGAGTTCATGATAGCC-3’。PCR反应体系25μL：10×PCR反应缓冲液2. 5μL、MgCl2(25mmol/L)1. 5μL、dNTPs(10mmol/L)0. 2μL、ATPDF1(10μmol/L)1μL、ATPDR1(10μmol/L)1μL、Taq酶(5u/μL)0. 3μL。扩增程序:94℃预变性3min，94℃30s，59℃30s, 72℃1min，35个循环，72℃延伸5min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 链格孢属小孢子种总DNA电泳检测结果

经1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用两种方法提取的链格孢属小孢子种基因组DNA均比较完整，且条带单一，蛋白质和多糖污染较少，无拖尾现象和无明显的RNA条带。从图可知，石英砂研磨法提取的DNA条带明亮，但带型细，而液氮研磨法提取的DNA带型较宽，但条带较暗。因此，仅通过电泳检测无法判断两种方法提取的DNA含量的高低，还需通过超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度。

2.2 超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度

纯DNA的A260/A280的比值是1. 8，大于1. 9，表明有RNA污染，小于1. 6，表明有蛋白质、酚类等污染[10]。从表2数据可知，两种方法提取的基因组DNA的A260/A280的比值均大于1. 9，说明基因组DNA中无蛋白质、酚类等污染，但含有少量的RNA污染。从图表中的A260/A280的比值和DNA浓度可知，两种方法提取链格孢属小孢子种总DNA的效果没有显著的差异。

2.3 PCR检测DNA的质量

采用链格孢属小孢子种的通用引物和特异性引物对提取基因组DNA的质量进行检测，结果表明通用引物ITS1和ITS4的扩增产物的分子量在500～700bp之间, 特异性引物ATPDF1和ATPDR1 扩增产物的分子量在1 000～2 000bp之间，两对引物扩增产物的分子量与预期结果一致，且均能扩增出单一、明亮、清晰的目的条带，并具有较好的特异性。两种方法提取的基因组DNA扩增效果相仿，均能满足PCR扩增的要求。

图1 液氮研磨法 图2 石英砂研磨法

表2 DNA提取效果

图3 液氮研磨法提取DNA的ITS-PCR图谱 图4 石英砂研磨法提取DNA的ITS-PCR图谱 图5 液氮研磨法提取DNA的ATP-PCR图谱 图6 石英砂研磨法提取DNA的ATP-PCR图谱

注：图3-6中的泳道1-6分别是6种不同的链格孢属小孢子种、CK为阴性对照、M为Maker2000

3 结论与讨论

基因组DNA的提取是真菌分子生物学中最基础的一项技术，快速高效提取质量高的DNA对后续试验有重要的意义。目前国内外报道真菌DNA提取的方法有CTAB法、SDS法[11]、蛋白酶K法[12]以及氯化苄法[13]等，不同方法的区别主要在于对细胞壁的破壁方式以及破壁后分离核酸、蛋白质方面上的不同，常用的破壁方式有:液氮冻融、-70 ℃冻融、酶消解、超声破碎、高盐溶液、尿素缓冲液处理[14]等，核酸分离包括经典的酚、氯仿抽提，以及商品化的纯化柱纯化膜分离法等[15]。

本文利用液氮研磨法和石英砂研磨法均能获得链格孢属小孢子种总DNA，通过分析比较两种方法提取的DNA效果无明显的差异，提取的DNA均能满足后续试验的需要。但液氮研磨法需要较多的菌丝体，增加了提取DNA的成本，同时使用液氮也有一定的危险性，而与液氮研磨法相比，石英砂研磨法具有如下优点：(1)避免使用费用和危险性都较高的液氮，此法为获取液氮不易的地方带来方便；(2)可以控制研磨时间和力度，避免浪费提取材料和避免对DNA造成损伤；(3)简单快速、时间短、成本低、安全可靠。因此，石英砂研磨法是链格孢属小孢子种用于病原种类研究所需总DNA提取的较为理想的方法。

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Comparing Total DNA Extraction Method onAlternariaSmall-sporedSpecies

Liu Zhenya Xiong Renci Zhu Tiansheng*

(College of Plant Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

Two extraction methods, quartzite sand grind and liquid nitrogen grind were applied to extract the genomic DNA fromAlternariasmall-sporedspecies,ThepurityandconcentrationofDNAwasdetectionedbyultramicrospectrophotometerandthequalityofDNAwasevaluatedwithagarosegelelectrophoresisandPCRamplification,inordertoscreenthesuitableDNAextractionmethodforAlternariasmall-sporedspecies.TheresultindicatedthatallofthetwomethodscouldobtaintheDNAandnosignificantdifferencebetweentwomethodsofextractingDNAeffect.Comparingthetwomethods,liquidnitrogengrindneedmoremycelia,longertimeandmoreexpensive,whilequartzitesandgrindingmethodwassimpleandfast,shorttime,inexpensive,andavoidedusingliquidnitrogen,whichwasadaptedtoDNAextractionofAlternariasmall-sporedspecies.

Alternariasmall-sporedspecies;DNAextraction;quartzitesandgrindingmethod;liquidnitrogengrindingmethod

2014-10-13

新疆生产建设兵团产学研重大合作科技专项(2013AA001-1)；北京市援助和田科技攻关项目(201106)。

刘振亚(1987-)，男，在读硕士，研究方向为果树病理学。 E-mail:liuzhenya_sm@126.com

E-mail:ztszky@163.com

1009-0568(2015)02-0094-06

S432.1

A

10.3969/j.issn.1009-0568.2015.02.018