上气道咳嗽综合征大鼠模型的建立与评价*

★ 曹治山史锁芳（1.南京中医药大学 南京210029；2.南京中医药大学第一附属医院 南京210046）

基于已发表文献中的造模方法均为单一的鼻窦炎模型或咽喉炎模型，本次实验结合国内外文献报道，选择国内常用的SD大鼠，在传统模型制作方法基础上进行适当改良摸索出一种新的上气道咳嗽综合征模型建立方法，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠20只，由南通大学实验动物中心提供（实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2008-0010）。将大鼠按体重采用随机区组法分为2组，每组10只。分别为：（1）对照组（170.81±6.17）g；（2）模型组（170.65±5.44）g；具有可比性。

1.2 材料与仪器（1）材料：膨胀海绵：由惠州华扬医疗器械有限公司生产。批号：20101102。红梅香烟：由红塔烟草（集团）有限公司生产，烟气烟碱量：0.9mg，焦油量：11mg，烟气一氧化碳：12mg。自制风箱大小约40cm×50cm×60cm。大鼠IL-8试剂盒，美国RB公司生产，编号：BPE30583，批号：20140506BN；大鼠TNF-a试剂盒，美国RB公司生产，编号：BPE30635，批号：20140510FV。

（2）主要仪器：莱卡切片机（德国Leica公司，型号：RM2128）；荧光显微镜（日本制造，OLYMPUS型号：BX51）；照相机（日本制造，型号：OLYMPUS C-35AD-2）等。

1.3 造模方法 采用膨胀海绵鼻腔填塞（鼻窦炎）联合香烟雾化（增加气道炎症）的方法[1-2］。先将大鼠腹腔注射麻醉后取膨胀明胶海绵片（3 mm×5 mm）置入大鼠左侧鼻腔，距离前鼻孔约15 mm，位于窦口鼻道复合体处。后用1ml注射器抽取0.5mL金黄色葡萄球菌悬浊液缓慢小心注入左侧鼻腔内，海绵滞留4周后，模型组大鼠，每天被动吸烟2h，连续20d。具体方法为：每天上午、下午将大鼠置于自制的风箱内，每次同时点燃3支香烟，持续约20min后，再点燃3支香烟，共自然燃烧9支香烟。6h后重复第2次吸烟。对照组以自由活动为主。采取记分法记录抓鼻、咳嗽、喷嚏、咯痰样次数评估鼻窦及咽喉不适程度。方法如下：（1）抓鼻、喷嚏：轻度抓鼻1分；频繁抓鼻2分；抓鼻不止3分。（2）咳嗽：2个以内1分，3～5个2分；5个以上3分。（3）清喉：轻度咯痰样1分；中度咯痰样2分；咯痰样不止3分。自香烟雾化结束后开始观察30min，采用叠加法记分，总分超过5分视为动物造模成功。

待出现症状后，随机从正常组和模型组各取2只作病理切片，模型组较正常组鼻窦组织黏膜明显充血水肿、鼻窦、咽喉大量的炎性细胞浸润等典型的鼻窦部病变及上气道炎症，视为造模成功。

1.4 一般状况观测 观察实验期间各组大鼠的呼吸频率、精神、饮食、活动、毛发、大小便等。

1.5 标本采集与观测

1.5.1 大鼠血样采集 常规方法采血后用于血清各指标的检测。

1.5.2 鼻窦部标本采集 大鼠麻醉处死后，完整切取头部：部分直接取鼻窦部标本冻存；部分用中性甲醛固定，取鼻窦部标本石蜡包埋，行HE染色。

1.5.3 咽喉壁标本采集 大鼠麻醉处死后，沿着大鼠舌根部位，依据解剖位置固定咽喉部位，完整切取咽喉壁组织：用中性甲醛固定，取咽喉壁标本石蜡包埋，行HE染色。

1.6 统计学处理 数据用SPSS16.0统计软件进行处理，所有数据用x-±s表示，各组间比较作t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 对照组大鼠反应正常。模型组经长时间鼻腔填塞及香烟雾吸后，出现抓鼻，鼻部不适，打喷嚏，发作性咳嗽，清嗓子，咯痰样，易激惹，饮水量明显增多，精神亢奋，食量减少，活动明显增加或烦躁不安等表现。造模后，造模各组大鼠鼻窦-咽部炎症状累计积分平均达到5分以上，与正常对照组有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 血清中炎性介质IL-8、TNF-a水平 大鼠模型组炎性介质IL-8、TNF-a水平明显升高，与对照组比较，P<0.03，有显著的统计学意义。

2.3 组织病理形态学的变化（HE染色）对照组鼻窦黏膜及咽喉壁粘膜上皮完整，未见炎症细胞浸润；模型组：鼻窦粘膜上皮细胞中度变性（++），纤毛变性坏死脱落（++），粘膜下层大量炎细胞浸润（+++）；咽后壁粘膜层上皮细胞中度变性、坏死、脱落（++），粘膜层及下层大量炎细胞浸润（+++）。

2.3.1 鼻窦黏膜组织（上鼻窦为主）（已切片，HE×40）

2.3.2 咽后壁（已切片，HE×10）

对照组 模型组

3 讨论

上气道咳嗽综合征（UACS），过去称鼻后滴漏综合征（PNDS），是慢性咳嗽最常见的原因之一，占持续咳嗽病因的40%~87%。隶属于中医学“风咳”、“久咳”范畴。众多医家从“风、痰、瘀、虚”等角度论治本病，但由于国内外缺乏本病动物模型的制造方法，因而中药制剂或单味药如何起效难以解释。欧洲呼吸学会（ERS）将其发病原因归咎于慢性鼻炎和鼻窦炎。而英国胸科学会（BTS）将这类导致慢性咳嗽的病因总结为“上气道疾病”。依据2009版的《咳嗽的诊断与治疗指南》[3］中对UACS/PNDS达成的共识，目前公认本病发病机制与鼻炎、鼻窦炎及气道炎症、气道敏感性等因素密切相关。本次造模的方法具备下列特点：

3.1 干预因素符合本病的特点 当慢性咳嗽的患者，有鼻炎、鼻窦炎病史或者咳嗽常伴有鼻窦部位或咽喉不适症状，应考虑UACS的可能。实验过程中，使用膨胀海绵填塞大鼠，而避开致敏的方法，使大鼠患上鼻窦炎，并且膨胀海绵长期滞留有利于鼻窦部位病分泌物倒流。同时观察到大鼠有明显抓鼻、间断咳嗽的情况。张罗等[4］详细阐述了导致UACS的鼻腔鼻窦疾病。亦有学者[5-6］对慢性咳嗽与鼻窦炎之间的相关性进行了探讨。得出了鼻窦炎是引起慢性咳嗽的主要原因之一。其次，气道炎症，是引起咳嗽的重要病理基础。短时间的烟雾刺激只是为增加气道炎症，而有别于与慢支、肺气肿的造模方法。时翠芹等[7］测定了气道炎症在UACS中的作用，结果提示气道炎症可能通过增加咳嗽敏感性而在慢性咳嗽的发生中起重要作用，下呼吸道黏膜肥大细胞激活可能是连接气道炎症和咳嗽的一个重要环节。张巧等[8］对92例慢性咳嗽并同时有咽部症状和体征的患者进行病因学分析，得出“慢性咽炎”在慢性咳嗽中的重要性不应被忽视。亦有学者[9-10］通过痰诱导的方式，得出不同病因慢性咳嗽患者存在不同气道炎症，其中鼻后滴漏综合征表现为中性粒细胞为主的气道炎症。

表1 造模前后大鼠鼻炎症状积分比较（x-±s，n=10）

表2 造模前后大鼠炎性介质IL-8、TNF-a水平（x-±s，n=10）

对照组 模型组

3.2 血清检测指标及病理染色符合本病的特点 既往研究发现[11］，在非过敏性慢性咳嗽（鼻后滴漏综合征、胃食管反流及特发性咳嗽）中，是以中性粒细胞浸润为主的气道炎症并伴有IL-8的表达增加。这与本实验结果是一致的。IL-8对中性粒细胞具有强烈的趋化作用，亦能促使中性粒细胞释放超氧化物、脱颗粒，并刺激花生四烯酸代谢产物的生成，从而导致机体局部炎症反应，达到杀菌和细胞损伤的能力；而肿瘤坏死因子-a在鼻粘膜损伤后，主要是局部的巨噬细胞释放TNF-a，使其浓度升高，它通过对早期炎症渗出、炎细胞的迁移、趋化、聚集与活化等起重要作用。因而，白细胞介素-8、肿瘤坏死因子-a的监测对鼻炎、鼻窦炎及气道炎症反应等有重要的意义[12-13］。

3.3 造模方面的不足 合格的动物模型研制是研究开发UACS新方法新制剂的基础和必要条件，为此我们进行了初步尝试。此次造模有机的将鼻窦病变、气道炎症等因素结合起来，符合上气道咳嗽综合征发病特点。可以初步认为此模型制作方法是有一定的推广价值的。但我们应当看到，咳嗽致病因素非常复杂，造模过程必须排除其他导致咳嗽的可能因素；大鼠的模型和人是有差别的，大鼠难以形象的表达出其不适症状。本病的干预因素及研究方法有待进一步研究和深入。

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