酶解偶联发酵体外模拟麝香猫咖啡的电子舌相关性分析

佟世生，王 丽，靳静言，崔忠义，刘 萍，*

（1.北京城市学院生物医药学部，北京100083；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

酶解偶联发酵体外模拟麝香猫咖啡的电子舌相关性分析

佟世生1，王 丽2，靳静言2，崔忠义2，刘 萍2，*

（1.北京城市学院生物医药学部，北京100083；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

使用电子舌检测，对发酵处理和酶解偶联发酵处理的云南小粒咖啡鲜果和生豆进行检测，将其与天然麝香猫咖啡和其他不同加工方式和产地的咖啡豆进行主成分分析和聚类分析，酶解偶联发酵咖啡鲜果所得模拟豆（MX模拟豆）与天然麝香猫咖啡豆的相似性最高，说明通过酶解偶联发酵咖啡鲜果可以得到与天然麝香猫咖啡风味相同的咖啡豆，为人工生产麝香猫咖啡豆提供了新思路。

咖啡发酵，电子舌，主成分分析法，云南小粒咖啡，麝香猫咖啡

麝香猫咖啡（Civet coffee），是咖啡鲜果被麝香猫（Civet）吃下，经过消化道消化后排泄出的咖啡生豆，具有特殊风味，但产量极低。Massimo[1]对天然麝香猫咖啡进行压缩实验发现，它们与未经麝香猫吞食的咖啡豆相比质地更坚硬且易碎，这表明麝香猫胃液渗透到了咖啡豆内部，胃蛋白酶或胰蛋白酶类蛋白酶可能通过内果皮对内部易感蛋白进行水解以改变咖啡烘焙后感官品质。Martinez等[2]利用阿拉比卡咖啡模拟麝香猫咖啡时，使用盐酸将消化环境调为1.5～2之间，并使用猪胃粘膜的胃蛋白酶（每克蛋白粉包含1000个胃蛋白酶单位）进行酶解处理。Mun[3]的研究发现苏门答腊麝香猫咖啡虽然与水洗咖啡香气组成相似，但麝香猫咖啡的香气组成更均衡。这说明微生物发酵在麝香猫咖啡品质形成中具有重要作用。目前关于麝香猫肠道内哪种微生物发酵使咖啡风味提高未见报道。Evangelista等[4]的研究中指出使用酵母菌对干法加工的咖啡豆进行发酵处理，可以显著地提高其饮用品质。但少有研究关注于采用酶解偶联纯种发酵以获得与麝香猫咖啡品质相似的咖啡生豆。

目前，使用现代分析仪器对咖啡的香气及感官品质进行分析的研究日益增加。Ongo等[5]的研究表明电子鼻和气-质联用（GC-MS）能够有效地区分四个产区的麝香猫咖啡及其普通咖啡，Várvölgyi等[6]研究发现在咖啡的感官评价中相比于SPME-GCMS，电子舌具有更好的辨识和区分能力，可见在咖啡得香气和感官品质评价中，现代分析检测技术已日臻完善，可以与传统的感官评价技术相结合，使咖啡的感官评价更加准确。

目前国外多采用酶解的方式进行体外模拟麝香猫咖啡的研究，本研究在确定了酶解的基础上，使用从咖啡中筛选的能够提高咖啡风味的菌株，进行酶解偶联发酵，在确定了最佳处理条件后，对纯种发酵咖啡生豆和鲜果，酶解偶联发酵云南小粒咖啡生豆和鲜果，以及不同加工工艺及产地的烘焙咖啡浸提液进行电子舌检测，通过主成分分析和聚类分析对体外模拟所得麝香猫咖啡豆与其他咖啡豆的相关性进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

咖啡生豆 2013年10月产自云南保山地区的发酵云南小粒（卡提姆）生豆；咖啡鲜果 2013年11月产自云南保山地区的发酵云南小粒（卡提姆）鲜果；所有成品咖啡生豆 英皇咖啡；胃蛋白酶 分析纯，购于淮安百麦绿色生物能源有限公司；盐酸、氯化钠、谷氨酸钠等 分析纯，购于北京化工厂；发酵菌株菌3 中国农业大学食品科学与营养工程学院，酶与发酵工程实验室，筛选自黄金曼特宁；咖啡液体培养基 称取一定量云南小粒咖啡生豆，用粉碎机充分粉碎后按1∶25比例量取蒸馏水，打浆混匀后过60目筛，将滤液置于121℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌15 min得到咖啡液体培养基；发酵种子液 发酵菌种接入咖啡液体培养基后于37℃条件下发酵14 h。

KQ3200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；DZKW-C型恒温水浴锅 北京中科星宇商贸有限公司；GENECAFÉ CBR-101咖啡烘焙机 Genesis Co.，Ltd；TSK-1171型滴漏式咖啡机 灿坤实业有限公司；TDL-40C型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；TFG-G型通风橱 广州佳镁铧实验设备有限公司；LX-C50L型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DNP-9272型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；PB-10型pH计 德国Sartorius公司；ASTREE电子舌（液体自动进样器、电化学传感器阵列、电子舌主机、80 mL标准烧杯） 法国ALPHAMOS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵生豆和发酵鲜果的制作 称取20 g云南小粒咖啡生豆置于3号自封袋中，按5%接种量将准备好的菌3液体培养液接入自封袋中生豆上，按袋中液体总量占生豆重量70%比例补足无菌水，倒入3号自封袋中，混匀密封后将自封袋置于37℃恒温培养箱中发酵4 h。发酵结束后用无菌水迅速冲洗干净，置于50℃烘箱中进行干燥，待其恒重后取出即得发酵生豆咖啡豆（FS）。

称取50 g剥去外果皮的云南小粒咖啡鲜果置于4号自封袋中，按5%接种量将准备好的菌3液体培养液接入自封袋中鲜果上，按袋中液体总量占鲜果20%的比例补足无菌水，倒入4号自封袋中，混匀密封后将自封袋置于恒温培养箱中发酵4 h，发酵温度为37℃。发酵结束后用无菌水迅速冲洗干净，置于50℃烘箱中进行干燥，待其恒重后取出，将鲜果外壳剥去即得发酵鲜果咖啡豆（FX）。

1.2.2 酶解偶联发酵生豆和酶解偶联发酵鲜果的制作 称取20 g云南小粒咖啡生豆置于3号自封袋中，添加胃蛋白酶1.5%，酶解时间为2 h，酶解温度为55℃，酶解完成后进行发酵，菌3接种量5%，外源添加蔗糖1.0%，发酵时间2 h，发酵温度为37℃，发酵结束后用无菌水迅速冲洗干净，置于50℃烘箱中进行干燥，待其恒重后取出即得酶解偶联发酵生豆（MS）。

称取50 g云南小粒咖啡鲜果置于4号自封袋中，添加胃蛋白酶1.5%，酶解时间为2 h，酶解温度为55℃，酶解完成后进行发酵，菌3接种量1%，外源添加大豆蛋白胨4%，发酵时间4 h，发酵温度为37℃，发酵结束后用无菌水迅速冲洗干净，置于50℃烘箱中进行干燥，待其恒重后取出即得酶解偶联发酵鲜果（MX）。

1.2.3 咖啡的烘焙及研磨工艺 准确称取100 g咖啡豆进行烘焙，初始温度150℃，之后以5℃/min的速度进行梯度升温到250℃后，恒温烘焙5 min。烘焙结束后按中等粒度粉碎备用。

1.2.4 电子舌待测样品的制备 准确称取各种粉碎完成的烘焙咖啡样品30 g，按固液比1∶10，90℃浸提10 min制备300 mL的烘焙咖啡浸提液。待浸提液冷却至室温后进行测量，每次测量取样品80 mL，每组实验重复3次。

表1 电子舌测定咖啡样品种类Table 1 Coffee species for measurement of electronic tongue

1.2.5 电子舌预处理 测样前使用0.01 mol/L的HCl、NaCl和MSG对传感器进行活化，活化时间1.5 h；检测时间120 s；样品搅拌速率1 r/s。在烘焙咖啡样品分析序列设置时，对咖啡浸提液0 h样品设置10次重复测量，目的是使传感器适应样品特征，达到对咖啡浸提液样品响应的稳定状态，其后样品设置3次重复。1.2.6 数据分析 实验数据使用Excel进行整理，使用SPSS 21.0对实验数据进行主成分分析和聚类分析。

2 结果与讨论

2.1 云南小粒咖啡生豆和非发酵型咖啡豆、发酵型咖啡豆的电子舌相关性分析研究

通过电子舌7个传感器的信息收集，运用主成分分析法得到未发酵云南小粒咖啡生豆与非发酵型咖啡豆、发酵型咖啡豆的差异结果见图1。结果表明，前2个主成分的贡献率分别为83.539%、7.463%，累计贡献率91.002%。所以取前2个主成分对应的特征向量所决定的两维子空间就能够充分保存原始数据的信息。2号云南小粒（卡提姆）与发酵型5号哥伦比亚、7号黄金曼特宁在第一主成分范围内相距较远。9号苏门答腊曼特宁与4号云南波邦在第一主成分范围内相距较近，在第二主成分范围内距离较远。在非发酵咖啡豆区域内，2号云南小粒（卡提姆）与1号云南铁皮卡、3号云南AA、4号云南波邦等非发酵型咖啡豆能够很好区分开来，可以看出在分析咖啡豆是否为发酵型咖啡豆时电子舌检测具有一定的准确性，能够有效地区分不同产地和加工方式的咖啡豆。

图1 未发酵云南小粒咖啡生豆与其他非发酵咖啡豆的电子舌主成分分析图Fig.1 Main components analysis of different roasted coffee brew between Yunnan beans and other unfermented beans

图2 未发酵云南小粒咖啡生豆与其他非发酵咖啡豆的电子舌聚类分析图Fig.2 Clustering analysis of different roasted coffee brew between Yunnan beans and other unfermented beans

图2为利用电子舌检测和区分云南小粒咖啡与非发酵型咖啡、发酵型咖啡浸提液的聚类分析图。通过对电子舌数据进行聚类分析，能够体现不同咖啡浸提液的风味主成分的相似性和差异性，能够直观的表现出不同种类咖啡豆的风味差异，从图2中可以看出，发酵型咖啡豆哥伦比亚与黄金曼特宁在1个平均单位的时候聚成一类，云南波邦与前两者距离为2个平均单位。云南AA与前三者距离为2个平均单位。云南铁皮卡与云南小粒（卡提姆）在8个平均单位的时候聚成一类，云南小粒（卡提姆）与哥伦比亚、黄金曼特宁距离最远，为25个平均单位。

2.2 发酵后云南小粒咖啡豆与非发酵型咖啡豆、发酵型咖啡豆的电子舌相关性分析研究

运用主成分分析得到发酵生豆（FS）与其他发酵类型咖啡豆的差异结果见图3。从图3中可以看出，14号发酵生豆（FS）与2号未发酵云南小粒（卡提姆）在第一主成分范围内距离较远，与5号哥伦比亚、7号黄金曼特宁、8号林东曼特宁距离较近，同处于发酵型咖啡豆区域内。7号黄金曼特宁咖啡豆与8号林东曼特宁咖啡豆距离较近，说明两者饮用品质较相似。12号巴西米纳斯与13号巴西EURO重合区域较大，且两者与14号的距离在第一主成分范围内较近，在第二主成分范围内较远。14号发酵生豆（FS）与其他发酵型咖啡豆能够很好区分开来，但位置仍处于发酵豆范围内，和未发酵云南小粒咖啡豆相比更接近高品质咖啡豆风味品质。

图3 发酵后云南小粒咖啡生豆与其他发酵咖啡豆的电子舌主成分分析图Fig.3 Main components analysis of different roasted coffee brew between fermented Yunnan beans and other fermented beans

图4 发酵云南小粒咖啡生豆（FS）与其他发酵咖啡豆的电子舌聚类分析图Fig.4 Clustering analysis of different roasted coffee brew between fermented Yunnan beans（FS）and other fermented beans

利用电子舌检测和区分发酵型云南小粒咖啡生豆与其他发酵型咖啡浸提液的聚类分析见图4。结果表明，林东曼特宁、黄金曼特宁和哥伦比亚三者距离最近，为1个平均单位。发酵生豆与前三者在3个平均单位的时候聚成一类。巴西EURO和巴西米纳斯也在1个平均单位的时候聚成一类。发酵型云南小粒（卡提姆）生豆与前两者在8个平均单位的时候聚成一类。未发酵型云南小粒（卡提姆）生豆与其他所有发酵型咖啡豆距离最远，为25个平均单位。说明通过对云南小粒（卡提姆）咖啡生豆进行纯种发酵，能够将其饮用品质提高到接近高品质发酵型咖啡豆水平。

2.3 酶解偶联发酵云南小粒咖啡豆与天然麝香猫咖啡的电子舌相似性分析

运用主成分分析得到酶解偶联发酵云南小粒咖啡与天然麝香猫咖啡豆的差异结果见图5。从图5中可以看出，胃蛋白酶酶解偶联菌3纯种发酵体外模拟的麝香猫咖啡豆与天然麝香猫咖啡豆等样品的浸提液均聚于一个区域内，6号MX与19号天然麝香猫咖啡的距离在第一主成分和第二主成分范围内均为最近，重合区域较多。18号MS模拟豆与19号天然麝香猫在第二主成分范围内距离较近，在第一主成分的范围内距离稍远。17号FX与19号天然麝香猫在第一主成分范围内距离较近，在第二主成分范围内稍远。说明通过胃蛋白酶酶解偶联纯种发酵模拟麝香猫咖啡能够有效提高云南小粒咖啡豆与天然麝香猫咖啡的相似性，且MX模拟豆接近天然麝香猫咖啡饮用品质的程度最高。

图5 酶解偶联发酵发酵云南小粒咖啡豆与麝香猫咖啡豆的电子舌主成分分析分析图Fig.5 Main components analysis between simulated civet coffee and natural civet coffee

图6 酶解偶联发酵发酵云南小粒咖啡生豆与麝香猫咖啡豆的电子舌聚类分析分析图Fig.6 Clustering analysis between simulated civet coffee and natural civet coffee

利用电子舌检测和区分发酵云南小粒咖啡与其他发酵咖啡浸提液的聚类分析见图6。从图6中可以看出，MX模拟豆与天然麝香猫咖啡豆在1个平均单位的时候聚为一类，MS模拟豆与前两者在5个平均单位的时候聚为一类，未发酵云南小粒（卡提姆）与其他咖啡豆的距离最远，位于25个平均单位处。聚类分析表明MX模拟咖啡豆与天然麝香猫咖啡豆相似性最高。其他通过胃蛋白酶酶解偶联纯种发酵体外模拟的麝香猫咖啡豆与天然麝香猫咖啡豆的距离均较其他非发酵型咖啡豆与发酵型咖啡豆更近。

3 结论

通过对电子舌检测数据的主成分分析和聚类分析，可以看出电子舌能够较好的区分不同种类及产地的咖啡豆制作的浸提液，能够应用于咖啡的感官品质分析和质量检测。

将发酵咖啡生豆（FS）、发酵咖啡鲜果（FX）、胃蛋白酶酶解偶联菌3纯种发酵咖啡生豆（MS）以及胃蛋白酶酶解偶联菌3纯种发酵咖啡鲜果（MX）这四种咖啡豆和天然麝香猫咖啡豆的烘焙后浸提液经电子舌测定，通过主成分分析与聚类分析两种方法结合分析，得到未发酵云南小粒（卡提姆）咖啡豆与发酵型咖啡豆哥伦比亚、黄金曼特宁咖啡豆的距离最远，为25个平均单位，发酵型云南小粒（卡提姆）生豆（FS）与发酵型咖啡豆哥伦比亚、黄金曼特宁、林东曼特宁咖啡豆在3个平均单位的时候聚成一类，MX模拟豆与天然麝香猫咖啡豆在1个平均单位的时候聚为一类。通过胃蛋白酶酶解偶联纯种发酵咖啡体外模拟的麝香猫咖啡豆与天然麝香猫咖啡豆的距离较其他非发酵咖啡豆与发酵型咖啡豆更近。MX模拟豆与天然麝香猫咖啡豆的相似性最高，说明通过酶解偶联发酵咖啡鲜果或是生豆可以得到与天然麝香猫咖啡风味相同的咖啡豆，为人工生产麝香猫咖啡豆提供了新思路。

[1]Massimo S R，M A Sanromán.Application of solid-state fermentation to food industry—a review[J].Journal of Food Engineering，2006，76（3）：291-302.

[2]Martinez L.Citric acid production by Aspergillus niger in solid state fermentation[J].Microbial Technology for Sustainable Development and Productivity，2002：135-138.

[3]Mun H A，N A Lum，A S D Cruz.Bacteria responsible for mucilage-layer decomposition in Kona coffee cherries[J].Applied Microbiology，1965，13（2）：201-207.

[4]Evangelista S R，Silva C F，da Cruz Miguel M G P，et al. Improvement of coffee beverage quality by using selected yeasts strains during the fermentation in dry process[J].Food Research International，2014，61：183-195.

[5]Ongo E，Falasconi M，Sberveglieri G，et al.Chemometric discrimination of Philippine civet coffee using electronic nose and gas chromatography mass spectrometry[J].Procedia Engineering，2012，47：977-980.

[6]Várvölgyi E，Gere A，Szöllo″si D，et al.Application of Sensory Assessment，Electronic Tongue and GC-MS to Characterize Coffee Samples[J].Arabian Journal for Science and Engineering，2015，40（1）：125-133.

Correlation analysis of simulation civet coffee by purebred fermentated coupling with pepsin enzymatic pre-hydrolysis in vitro with electronic tongue

TONG Shi-sheng1，WANG Li2，JIN Jing-yan2，CUI Zhong-yi2，LIU Ping2，*
（1.Beijing City University，Beijing 100083，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

In this research，the detection of fermentation and enzyme uncoupling fermentation processing of Yunnan arabica coffee fruit and green bean was carried out by electronic tongue detection.Then the principal component analysis and cluster analysis it was used to analyzing the relationship among the natural civet coffee and other different processing methods and origins of the coffee beans.The result showed that the fermentation and enzyme uncoupling beans（MX simulation beans）and natural civet coffee beans were similar highest，which proved that the fermentation and enzyme uncoupling of coffee fruit could get the same natural civet coffee flavor of coffee beans，and provided a new idea for the production of artificial musk cat coffeebeans.

coffee fermentation；electronic tongue；principal component analysis；coffee arabica in Yunnan province；civet coffee

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0133-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.019

2015－04－14

佟世生（1970-），男，博士，副教授，研究方向：农产品贮藏与加工，E-mail：shishengt@163.com。

*通讯作者：刘萍（1970-），女，博士，副教授，研究方向：生物技术，发酵工程，E-mail：liuping@cau.edu.cn。