SPE-UPLC法测定豆芽中6-苄基腺嘌呤含量及其残留动态

刘雨思，王 波，闫 衡，刘倩倩，王彦淳，周 围，*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘肃出入境检验检疫局综合技术中心，甘肃兰州730020）

SPE-UPLC法测定豆芽中6-苄基腺嘌呤含量及其残留动态

刘雨思1，王 波2，闫 衡1，刘倩倩2，王彦淳1，周 围2，*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘肃出入境检验检疫局综合技术中心，甘肃兰州730020）

采用固相萃取超高效液相色谱法，建立豆芽中生长激素6-苄基腺嘌呤（6-BA）残留量的检测方法，并对不同贮存条件及贮存时间下豆芽中6-BA含量的变化进行动态研究。选用DIONEX Acclaim C16（4.6 mm×150 mm，3 μm）色谱柱，流动相采用甲醇、乙酸铵水溶液，流速为1 mL·min-1，检测波长为265 nm。结果表明，该方法回收率为87.4%～90.0%，相对标准偏差为0.46%～0.60%，方法检出限为0.01 mg·kg-1，6-BA的线性范围为0.05～50 mg·kg-1。该方法简单、快速，可实现对植物生长激素6-BA的准确定量。动态研究结果表明，豆芽中6-BA的含量会随时间的增加而降低，冻藏和冷藏方式下，最小半衰期分别为1.642 d和3.108 d。

超高效液相色谱，6-BA，豆芽，残留动态

豆芽因其富含蛋白质、碳水化合物、脂肪、钙、维生素且口感极佳，为广大消费者所喜爱，市场需求量极大[1]。6-苄基腺嘌呤（6-henzylaminopurine，6-BA）是一种人工合成的植物生长激素[2]，具有促进植物生长发育的作用[3]，能够明显提高果品及叶片的品质[4]，因此被广泛应用于蔬菜生产中。但是，6-BA作为一种生长激素，具有一定毒性，人体过多摄入会刺激皮肤、黏膜，造成食道、胃黏膜损伤，出现恶心、呕吐等现象[5-6]。

目前，豆芽因没有相关的国家检测标准，所以关于6-BA在豆芽生产中的使用存在争议。此前，6-BA被认为是非法添加物，不得在食品生产加工添加使用[7]。但是，对6-BA的进一步研究结果表明，低剂量6-BA的摄入对人体不会造成任何危害[8]。故而2014年11月6日，《食品安全国家标准-豆芽》（草稿）明确将6-BA定性为植物生长调节剂，允许其在豆芽生产中使用，限定含量为不得超过0.2 mg·kg-1[9-14]。然而，对6-BA的检测存在众多难点。由于6-BA在植物中会发生降解现象，残留的6-BA含量较少，且豆芽中含有大量杂质干扰目标物[15]，使检测及准确定量其残留量增加了难度，极易造成误判甚至错判，为豆芽带来安全隐患，而目前相关的研究较少。目前，检测6-BA含量的方法主要有HPLC法[16-18]、GC/MS法[19-20]和液质联用法[21-26]，但因其灵敏度低、准确度差、分析时间长，难以满足大批量的检测要求。

本实验选用Waters Oasis HLB小柱进行固相萃取[27-28]，对6-BA进行富集净化，采用UPLC法对6-BA在豆芽中的降解情况进行研究，并通过LC-MS进行定性分析。为6-BA的检测提供了一种快速有效的方法，并为相关机构制定豆芽中6-BA残留限量标准提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

6-苄基腺嘌呤 纯度98%，购自美国Dr. Ehrenstorfer公司；乙酸铵 色谱纯，购自德国CNW Technologies公司；甲醇 色谱纯，购自德国Mreck公司；蒸馏水 购自中国广州屈臣氏食品饮料有限公司；所用的豆芽空白样品 绿豆芽，扁豆芽，黄豆芽，均来自实验室自发豆芽；检测豆芽 购买于兰州各地蔬菜市场及大型超市。

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪 美国Waters公司；超高效液相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；Oasis HLB固相萃取柱 美国Waters公司；Sartorius BL610电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；3K30高速冷冻离心机 德国SIGMA公司；T25BASIC均质机 德国IKA公司；移液枪 美国Thermo Electron公司；50 mL聚乙烯管。

1.2 溶液配制

标准贮备液配制：精确称取0.01 g（精确至0.0001 g）6-BA标准品，置于500 mL容量瓶中，用甲醇∶水（V/V=9∶1）混合液溶解后，充分摇匀，定容至刻度线，配制成20 mg·L-1的6-BA标准储备液，4℃冷藏保存待用。

标准工作储备液配制：准确转移25、5、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025 mL标准储备液分别稀释为50、10、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的标准工作液，4℃冷藏待用。

1.3 检测步骤

1.3.1 样品提取 称取捣碎混匀的豆芽样品5.00 g（精确至0.01 g）于50 mL聚乙烯离心管中，加入15 mL甲醇水溶液（v/v=7∶3），用均质机均质3 min，然后以13000 r·min-1离心10 min，取全部上清液并用蒸馏水定容至30 mL，待净化[29]。

1.3.2 样品净化 固相萃取柱Oasis HLB（6 cc/200 mg，Waters，美国）按以下方法对样品进行富集净化，过程如下：

活化：分别用5 mL甲醇，5 mL水活化固相萃取柱；上样：提取液全部上柱，上样流速控制在1 mL·min-1以内；淋洗：5 mL水、5 mL甲醇水（v/v=1∶1）；洗脱：5 mL甲醇[30-32]。

将上述洗脱液旋转蒸发至近干，准确加入1 mL甲醇，漩涡振荡1 min，用0.45 μm有机滤膜过膜，上机测定。

1.4 色谱条件

1.4.1 超高效液相色谱仪色谱条件 色谱柱：DIONEX Acclaim C16色谱柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流速：1 mL·min-1；进样量：5 μL；柱温：30℃；流动相：A：甲醇，B：乙酸铵水溶液（30 mmol/L）。采用等度洗脱方式，洗脱程序：0～10 min，45%A。检测器：紫外检测器，检测波长265 nm[28]。

1.4.2 超高效液相色谱-质谱联用仪色谱条件 色谱柱：Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，5 μm）；流速：0.2 mL·min-1；进样量：5 μL；柱温：30℃；流动相：A：甲醇，B：乙酸铵水溶液（30 mmol/L）。采用等度洗脱方式，洗脱程序：0～10 min，45%A。

1.5 质谱检测条件

离子源：电喷雾离子源（ESI＋）；采集方式：MRM；干燥气温度：300℃；干燥气流量：7 L·min-1；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11 L·min-1；毛细管电压：3.5 kV。质谱检测参数值见表1。

表1 6-BA质谱检测参数设定表Table 1 MRM parameters of 6-BA

1.6 空白样品豆芽中6-BA的消解

在室温25℃下，用自来水培养6 d后收获，收获后的豆芽分别以冷藏（5℃）和冻藏（-20℃）方式储存，每天检测豆芽中6-BA残留量的变化，以消解动态方程评价消解效果，消解动态方程为C=C0e-kt，式中：C为生长激素残留量，mg·kg-1；C0为生长激素初始浓度，mg·kg-1；k为降解速率常数，d-1；t为时间，d；当C= 0.5×C0时，t为半衰期。

2 结果与讨论

2.1 实验条件选择和优化

图1 6-BA标准色谱图Fig.1 Chromatogram of 6-BA standard

2.1.1 6-BA标准色谱图 按“1.4.1超高效液相色谱仪色谱条件”所述方法测得6-BA的标准图如图1所示，6-BA添加量为10 mg·kg-1，出峰时间为7.6 min。

2.1.2 色谱柱选择 首先选用MGⅢC18（3.0 mm I.D. ×100 mm，3 μm）色谱分析柱，C18色谱柱是以硅烷化键合型（Si-O-Si-C）存在的，实验所分析的目标化物6-BA在该色谱柱上虽有很好的保留，但样品中的杂质对目标物存在较大的干扰（图2A）。为了使目标物更好的与杂质分离，选用Acclaim®Polar Advantage C16（4.6 mm×150 mm，3 μm）色谱柱，C16柱对极性化合物具有出色的保留能力和分离度，与C18柱相比具有独特的选择性，疏水性比C18柱弱，实验证明目标物在C16柱上保留效果好且峰形良好，有效避免了杂质对6-BA在色谱柱上的干扰，从而满足样品分离的要求（图2B）。

图2 选用不同色谱柱的黄豆芽样品和6-BA标准对比图Fig.2 Comparision of soybean sprouts characterized by twochromatographic columns

2.1.3 萃取溶剂选择 甲醇是一种通用型提取溶剂，且能与水互溶，适合分析含水量较高的豆芽样品。实验分别用酸化甲醇、甲醇∶水（V/V=7∶3）混合液和甲醇∶水（V/V=5∶5）混合液对样品进行提取对比。结果表明，三种提取溶剂对目标化合物的提取均有较好的回收率，平均回收率均在90%以上，但酸化甲醇会提取更多的杂质，干扰6-BA的检测，因此不选用酸化甲醇。水相含量大虽然有利于样品在固相萃取柱上的保留，但会增加水溶性杂质的提取量，且有机相含量大目标物提取率高，故选择甲醇∶水（7∶3）混合液为提取溶剂，而不选择甲醇∶水（5∶5）的混合液。

2.1.4 固相萃取柱的选择 由于豆芽样品种类繁多，成分复杂，干扰物较多，必须对样品进行净化，本实验采用固相萃取技术对样品进行前处理。分别使用Waters Oasis®MAX柱和Waters Oasis®HLB固相萃取柱进行净化。6-BA极性较小，难溶于水，微溶于乙醇，可溶于酸、碱，在酸、碱条件下均稳定。实验表明，样品提取液过柱时，吸附剂为混合型阴离子交换填料的Oasis®MAX固相萃取柱不能对6-BA有较好的保留，无法进行进一步的分析。而使用固相萃取柱为亲水亲脂平衡聚合物的Waters Oasis®HLB柱，其填料为亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，可以极好的保留中强极性的物质，所以采用Waters Oasis®HLB固相萃取柱对样品中6-BA进行净化、浓缩。

2.1.5 固相萃取条件优化 在Waters Oasis®HLB固相萃取柱上，本实验中以甲醇∶水（7∶3）混合液作为提取液，采用甲醇水混合溶液进行淋洗，目的在于增强6-BA与固定相的结合，同时除去不需要的组分和杂质，并通过调节水中甲醇的不同浓度，最大可能的去除杂质而不洗脱分析物。实验选取甲醇∶水（V/V）分别为5∶5、6∶4、7∶3的三种混合液作为淋洗液进行优化，最终以甲醇∶水（5∶5）混合液作为淋洗液。洗脱溶液的选择目的在于使分析物完全洗脱，经筛选实验确定以5 mL纯甲醇溶液洗脱，回收率较好，除杂质效果理想。故最终确定固相萃取条件为5 mL水，5 mL甲醇：水（5∶5）混合液淋洗，5 mL甲醇洗脱。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围和检出限 选取50、10、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的6-BA标准工作液，按“1.4色谱条件”进行测定，绘制样品浓度（横坐标X，mg·L-1）与峰面积（纵坐标Y，AU）标准曲线，进行线性回归分析，且当信噪比为3（S/N=3）时，该方法对6-BA的最低检出限（LOD）为0.01 mg·L-1。分析结果，如表2所示。结果表明，该方法在0.05～50 mg·kg-1线性范围内，线性良好。

表2 线性范围及检出限Table 2 The linear range and limit of detection

表3 方法加标回收率及精密度Table 3 The linear range and limit of detection

2.2.2 样品加标回收率和精密度 本实验中空白样品均来自于实验室自发的黄豆芽、绿豆芽和扁豆芽。在豆芽的成熟期（6 d）后进行样品添加回收测定，分别取三种不同品种的空白豆芽样品，每一个品种取3份，每份5.0 g，分别加入0.5、2.0、10 mg·kg-1的6-BA标准溶液，按照“1.3检测步骤”进行前处理操作后，按“1.4.1超高效液相色谱仪色谱条件”进行测定，以浓度值计算加标回收率，没有基质干扰。为得到测定方法的精密度，实验对每一添加浓度样品重复测定9次。结果表明：6-BA的平均回收率在87.4%～90.0%之间，相对标准偏差（RSD%）在0.46%～0.60%之间。方法的回收率和重现性均较好。所得结果见表3。

图3 豆芽空白样品及6-BA添加样品对比图Fig.3 Comparision chromatogram of blank sprouts’sample and 6-BA sprouts’sample

综上所述，此方法回收率较高，且精密度良好，因此实验方法能满足各个品种豆芽中6-BA残留量的检测要求。豆芽添加样品及空白样品检测结果如图3所示。结果显示，三种空白样品中均未检测到6-BA，而添加样品中检测到的6-BA色谱峰不受豆芽中杂质干扰，精密度较高，适用于豆芽样品中6-BA的检测。

2.3 6-BA在豆芽中的降解动态

供试的三种不同品种的空白豆芽样品均为实验室自发豆芽，统一在豆芽成熟期后，向三种空白豆芽样品中添加浓度为10 mg·kg-1的6-BA，于添加后1～15 d内每天检测豆芽中6-BA的含量。图4中A为冷藏（5℃）方式，B为冻藏（-20℃）方式，由图4所见，在冷藏条件下6-BA在三种不同的豆芽品种中残留量的变化为，0～4 d含量消解速率极快，4～12 d含量消解速率平缓；在冻藏条件下6-BA在三种不同的豆芽品种中残留量的变化为，0～10 d含量消解速率极快，10～15 d含量消解速率平缓。

图4 不同贮藏方式下6-BA的残留动态Fig.4 Dynamics of residues of 6-BA stored by different conditions注：A为冷藏条件下；B为冻藏条件下。

由表4可知，6-BA在冻藏方式下贮藏的黄豆芽、绿豆芽、扁豆芽中的原始沉积量分别为9.83、9.76、9.83 mg·kg-1，黄豆芽降解速度最快，绿豆芽次之，扁豆芽最慢，半衰期分别为3.108、3.349、3.675 d；6-BA在冷藏方式下贮藏的黄豆芽、绿豆芽、扁豆芽中的原始沉积量分别为9.79、9.59、9.91 mg·kg-1，黄豆芽降解速度最快，绿豆芽次之，扁豆芽最慢，半衰期分别为1.642、1.723、1.808 d。冻藏方式可以较好地减缓6-BA在豆芽中的降解速率。

表4 不同贮藏方式下6-BA的的残留动态（n=7）Table 4 Dynamics of residues of 6-BA stored by different conditions（n=7）

2.4 实际样品检测

本实验对各大型超市及蔬菜市场中30批豆芽进行检测，其中，黄豆芽、绿豆芽及扁豆芽分别在超市与蔬菜市场抽取5个样品。检测结果表明，在市场购买的黄豆芽样品及绿豆芽样品中有两批样品检出6-BA，含量分别为5.3 mg·kg-1和2.1 mg·kg-1。

2.5 阳性样品验证

实验首先采用10 mg·kg-16-BA标准溶液，进行MRM质谱条件优化，使用“1.5质谱条件”对1 mg·kg-1标准品和三种不同种类的阳性样品同时进行检测后发现，阳性样品中的目标物质和标准品中的目标物质出峰时间相同，离子丰度均相同（图5），因此可以进一步验证所测阳性样品中的目标物质为所要检测的6-BA。

3 结论

该方法在超高效液相色谱仪上，用离子色谱柱作为分离手段，对植物生长激素6-BA进行了很好的分离分析，操作简单快速，灵敏度高，检出限较低，重现性好，此方法尚未见报道，是分析植物生长中添加6-BA值得推广的方法。本文还跟踪研究了6-BA在豆芽中的降解过程，根据实验结果显示，6-BA在豆芽中会在短时间内大量消解，因此对豆芽中添加的6-BA残留量进行检测时，需要在抽样后尽快进行检测，并注重抽样样品的保存方法，抽样后立即冻藏保存，这样能最真实有效的反映出6-BA在样品中的残留量。

图5 6-BA标准与阳性样品对比谱图（MRM）Fig.5 Comparision spectra chromatogram of 6-BA standard andthe positive sample

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Determination of 6-BA and its residual dynamics in bean sprouts by SPE-UPLC

LIU Yu-si1，WANG Bo2，YAN Heng1，LIU Qian-qian2，WANG Yan-chun1，ZHOU Wei2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730020，China）

This study was aimed to set up a novel method to detect the residual content of 6-Benzylaminopurine（6-BA）of three kind of bean sprouts with the solid-phase extraction-ultra performance liquid chromatography and try to indicate the dynamic variation of content of 6-BA in bean sprout with different storage conditions and interval times.DIONEX Acclaim C16（4.6 mm×150 mm，3 μm）was used and the mobile phases were methanol and ammonium acetate，respectively，with a ratio of 45%methanol.Flow velocity was 1 mL·min-1and the detection wavelength was 265 nm.The results showed that spiked recoveries were 87.4%～90.0%.The relative standard deviation was 0.46%～0.60%.Detection limit and linear range of 6-Benzylaminopurine was about 0.01 mg·kg-1and 0.05～50 mg·kg-1respectively.The novel method was quite easy to use and could be used to detect accurately the content of 6-BA.The content of 6-BA showed the drop trend with the rise of storage time and the minimum half-life period was 1.642 and 3.108 d respectively under the conditions of frozen storage and cold storage.

SPE-UPLC；6-BA；bean sprouts；residual dynamics

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0061-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.004

2015－01－08

刘雨思（1988-），女，在读硕士研究生，主要从事环境、食品药品的分析与检测方面的研究，E-mail：lys2931@126.com。

*通讯作者：周围（1957-），男，博士，研究员，主要从事食品营养及食品安全分析方面的研究，E-mail：zhouwei845@163.com。