硫氧环蛋白过氧化物酶3对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的影响

2015-04-24赵霞梁婷婷裴强王洪波范玉磊魏中秋冯莉孙影

中国医药导报 2015年21期

赵霞梁婷婷裴强王洪波范玉磊魏中秋冯莉孙影▲

1.河北联合大学冀唐学：医学实验中心，河北唐山063300；2.河北联合大学基础医学：病理学系，河北唐山063000；3.河北联合大学附属遵化市人民医院心内科，河北唐山064200；4.河北联合大学附属遵化市人民医院外科，河北唐山064200

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目的观察硫氧环蛋白过氧化物酶3（Prdx-3）在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导心肌细胞肥大中的作用，并探讨其作用机制。方法体外培养心肌细胞（H9C2）随机分为对照组、AngⅡ组、AngⅡ+转染对照组和AngⅡ+Prdx-3转染组。脂质体转染法将Prdx-3表达质粒转染心肌细胞，Western blot法检测Prdx-3蛋白表达，Real-time PCR法检测脑钠素（BNP）mRNA表达，二氯荧光素二乙酸（DCFH-DA）检测活性氧（ROS）水平。结果Prdx-3表达质粒转染心肌细胞后，Prdx-3蛋白表达值为（0.88±0.12），高于转染对照组（0.38±0.05），差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，AngⅡ组BNP mRNA[（1.00±0.00）比（1.72±0.29）]、ROS[（3473±81）比（4439±111）]及Prdx-3蛋白表达水平[（0.33±0.05）比（0.72±0.14）]均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。AngⅡ+转染对照组和AngⅡ组的BNP mRNA[（1.72±0.29）比（1.94±0.34）]、ROS[（4439±111）比（4285±167）]及Prdx-3蛋白水平[（0.72± 0.14）比（0.75±0.11）]比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与AngⅡ组比较，AngⅡ+Prdx-3转染组BNP mRNA [（1.72±0.29）比（1.29±0.15）]和ROS水平[（4439±111）比（3648±254）]明显下降，但Prdx-3蛋白水平[（0.72±0.14）比（1.89±0.37）]显著增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论AngⅡ可通过ROS诱导心肌细胞肥大，而Prdx-3通过降低ROS抑制AngⅡ的作用。

硫氧环蛋白过氧化物酶3；活性氧；心肌肥大；血管紧张素Ⅱ

高血压性心脏病主要病理表现是心肌肥大，但持续性心肌肥大会导致心力衰竭。笔者前期研究发现，在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的高血压模型中，心肌组织中活性氧（ROS）水平明显增高，氧化反应被过度激活；增高的ROS通过参与异常的细胞内信号传导通路或损伤DNA、蛋白质、脂质等物质促进细胞增殖、肥大、凋亡等[1-2]。硫氧环蛋白过氧化物酶3（Peroxiredoxin-3，Prdx-3）是一种新型过氧化物酶，存在于线粒体，与硫氧还蛋白2（thioredoxin-2，Trx-2）一起清除来自于线粒体的ROS[3]。Prdx-3在多种病理过程中均表达上调，以减少组织氧化应激损伤[4]。但在高血压诱导的心肌肥大中，Prdx-3是否可被激活并对心肌肥大进行调控，目前报道较少。本研究利用AngⅡ刺激正常或Prdx-3表达质粒转染的心肌细胞，通过检测脑钠素（BNP）、ROS和Prdx-3等指标的变化，探讨Prdx-3在AngⅡ诱导心肌肥大过程中的作用及机制，为Prdx-3成为靶向治疗新靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

H9C2大鼠心肌细胞（中国科学：上海生命科学研究：）；血管紧张素Ⅱ（Sigma公司产品）；Prdx-3表达质粒（上海吉玛公司合成）；BNP上下游引物（上海吉玛公司合成）；M-MLV逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司）；SYBR+Tap混合剂（美国Invitrogen公司）；Prdx-3抗体（美国Abcam产品）；二氯荧光素二乙酸（Sigma公司）。

1.2 细胞培养及实验分组

心肌细胞在含10%胎牛血清浓度的杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM）中常规培养，达到70%融合后分为四组。①对照组：以0.4%血清浓度DMEM孵育细胞；②AngⅡ组：0.4%血清浓度DMEM培养条件下，给予AngⅡ（1×10-6mol/L）孵育细胞；③AngⅡ+转染对照组：脂质体Lipo 2000将空质粒载体转染心肌细胞24 h，0.4%血清浓度DMEM培养12 h（同步化）后，给予AngⅡ（1×10-6mol/L）孵育细胞；④AngⅡ+Prdx-3转染组：脂质体Lipo 2000将Prdx-3表达质粒转染心肌细胞24 h，0.4%血清浓度DMEM培养12 h，给予AngⅡ（1×10-6mol/L）孵育细胞。

1.3 Western blot法检测Prdx-3在心肌细胞内的表达

各组细胞同步化后经或未经AngⅡ刺激30 min，PBS漂洗，细胞裂解液冰上震荡裂解30 min后收集裂解细胞，低温高速离心15 min，收集上清。考马斯亮蓝R-250染色测定蛋白浓度，每孔50 μg上样并电泳和转膜。5%牛血清白蛋白封闭1 h，Prdx-3抗体（1∶1000稀释）4℃孵育过夜。次日，二抗（1∶3000稀释）室温孵育2 h后，BCIP/NBT（1∶50稀释）显色3 min。Image J软件对蛋白表达条带进行灰度定量分析，以Prdx-3与GAPDH灰度比值作为Prdx-3表达值。

1.4 Real time PCR法检测BNP mRNA表达[5]

各组细胞同步化后经或未经AngⅡ刺激24 h，Trizol提取细胞总RNA，定量后取0.5 μg RNA行逆转录。1 μL cDNA进行Real-time PCR扩增，扩增体系如下：SYRB+Taq混合剂10 μL、Prx-1或GAPDH上下游引物各0.5 μL、cDNA 1 μL、双蒸水8 μL；扩增条件：95℃变性30 s后，95℃变性5 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40个循环。BNP上游引物序列5'-TGGGCAGAAGATAGACCGGA-3'，下游引物5'-ACAA CCTCAGCCCGTCACAG-3'；GAPDH上游引物5'-GGC ACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游引物5'-ATGGTG GTGAAGACGCCAGTAA-3'。GAPDH为内参照，各组BNP mRNA表达量以各样本与对照组的倍数表示。

1.5 二氯荧光素二乙酸（DCFH-DA）检测ROS水平

DCFH-DA没有荧光，能自由穿过细胞膜，进入细胞后被酯酶水解生成还原型二氯荧光素（DCFH），DCFH不能通过细胞膜，但可被细胞内的ROS氧化生成氧化型二氯荧光素（DCF），DCF可发出荧光，因此DCF的荧光量可以反映细胞内ROS水平。本实验细胞同步化后，AngⅡ刺激20 min，经0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，加入DCFH-DA，终浓度为10 μmol/L，37℃孵育20 min，PBS洗3次，计数10 000个细胞，在荧光酶标仪测定激发波长488 nm、发射波长525 nm处的荧光强度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Prdx-3表达质粒转染心肌细胞后Prdx-3蛋白表达

心肌细胞（未经AngⅡ刺激）经空质粒或Prdx-3表达质粒转染24 h后，Western blot检测Prdx-3蛋白表达。结果显示，转染对照组Prdx-3蛋白表达值为（0.38±0.05），Prdx-3表达质粒转染后Prdx-3蛋白表达值为（0.88±0.12），是转染对照组的2.3倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 BNP mRNA表达

与对照组比较，AngⅡ组BNP mRNA表达增高[（1.72±0.29）比（1.00±0.00）]，差异有统计学意义（P＜0.05）；AngⅡ组与AngⅡ+转染对照组[（1.94±0.34）]比较，BNP mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05），但AngⅡ+Prdx-3转染组BNP mRNA表达（1.29±0.15）明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 Western blot法检测Prdx-3表达质粒转染心肌细胞后Prdx-3蛋白表达

2.3 ROS水平

对照组荧光强度为（3473±81），AngⅡ组荧光强度为（4439±111），差异有统计学意义（P＜0.05）。与AngⅡ组比较，AngⅡ+转染对照组荧光强度为（4285±167），差异无统计学意义（P＞0.05），但AngⅡ+Prdx-3转染组荧光强度为（3648±254），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 Prdx-3蛋白表达

对照组Prdx-3蛋白的表达值为（0.33±0.05），AngⅡ组Prdx-3蛋白表达值为（0.72±0.14），差异有统计学意义（P＜0.05）。与AngⅡ组比较，AngⅡ+转染对照组Prdx-3蛋白的表达值为（0.75±0.11），差异无统计学意义（P＞0.05），但AngⅡ+Prdx-3转染组的Prdx-3蛋白的表达值为（1.89±0.37），差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 Western blot法检测各组细胞Prdx-3蛋白表达情况

3 讨论

ROS包括氧自由基、过氧化物和激发态氧等，具有很高的化学活性。正常时体内ROS的浓度很低，对机体具有保护作用，但过多的ROS可导致脂质过氧化、DNA链断裂、蛋白质修饰变性，从而导致细胞凋亡和坏死[6]。另外，过多ROS还与心肌细胞肥大密切相关。研究表明，ROS是细胞信号传导通路的重要成员，通过激活细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）及核因子κB（NF-κB）等途径介导多种细胞因子或活性因子的促心肌细胞肥大作用[7]。线粒体是心肌细胞产生ROS的重要场所，主要通过线粒体呼吸链电子泄漏产生[3]。最近研究显示，心脏微环境内的肾素-血管紧张素-醛固酮系统还可通过诱导ATP±赖的K+离子通道开放来促进线粒体产生更多的ROS，并由此引起Ⅰ型钠氢交换体和碳酸氢钠协同转运蛋白的激活，最终引起心肌细胞肥大[8]。

Peroxiredoxin家族是一种新型的过氧化物酶，Prdx-3是该家族成员中唯一特异性定位于线粒体的酶蛋白，在内质网中合成后经过线粒体定位信号转运到线粒体。Prdx-3、Trx2及硫氧还蛋白还原酶2（TrxR2）一起构成Prdx-3-Trx-TrxR氧化还原体系，催化来自线粒体的H2O2转变成H2O，从而调控线粒体内H2O2浓度水平，保护细胞免于来自线粒体的氧化应激[9-10]。有研究显示，Prdx-3能够保护肝癌细胞免于氧化应激诱导的细胞凋亡[11]，高表达Prdx-3在毒物诱导的大鼠海马区神经损伤中发挥保护作用[12]。在本研究中，AngⅡ刺激心肌细胞30 min后Prdx-3蛋白表达明显高于对照组，说明AngⅡ能够上调心肌细胞Prdx-3表达。

本研究利用Prdx-3表达质粒转染心肌细胞使心肌细胞高表达Prdx-3蛋白，并观察高表达Prdx-3对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大和ROS的影响。结果发现，AngⅡ使心肌细胞BNP mRNA的水平增加了1.7倍，Prdx-3表达质粒转染后BNP mRNA的水平下降了23.5%（P＜0.05），而转染对照无明显变化，提示Prdx-3高表达能抑制AngⅡ诱导心肌细胞肥大。同时，高表达Prdx-3对AngⅡ诱导的ROS也有抑制作用，AngⅡ作用20 min后ROS的表达量较对照组明显增加，Prdx-3表达质粒转染后ROS水平下降，说明Prdx-3可通过抑制ROS来抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

综上所述，AngⅡ可通过ROS诱导心肌细胞肥大，高表达Prdx-3通过降低ROS水平来抑制AngⅡ促心肌细胞肥大作用。因此，Prdx-3有望成为心肌肥大基因治疗的新靶点。

[1]Sun Y，Carretero OA，Xu J，et al.Deletion of Inducible Nitric Oxide Synthase Provides Cardioprotection in Mice With 2-Kidney，1-Clip Hypertension[J].Hypertension，2009，53（1）：49-56.

[2]Xuan CL，Yao FR，Guo LR，et al.Comparison of extracts from cooked and raw lentil in antagonizing angiotensinⅡ-induced hypertension and cardiac hypertrophy[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（19）：2644-2653.

[3]王大宁.PrxⅢ在去甲肾上腺素诱导H9C2细胞凋亡过程中的表达变化[D].石家庄：河北医科大学，2008.

[4]Li L，Zhang YG，Chen CL，et al.Anti-apoptotic role of peroxiredoxinⅢin cervical cancer cells[J].FEBS Open Bio，2012，22（3）：51-54.

[5]高卫民，曹志鹏，米丽，等.急性心功能障碍大鼠心肌中BNP的表达[J].法医学杂志，2013，29（2）：86-90.

[6]苏丽华，王璇琳，贺敏，等.黑青稞籽皮提取物对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].中国医药导报，2014，11（12）：21-24.

[7]Chen G，Pan SQ，Shen C，et al.Puerarin inhibits angiotensinⅡ-induced cardiac hypertrophy via the redox-sensitive ERK1/2，p38 and NF-κB pathways[J].Acta Pharmacol Sin，2014，35（4）：463-475.

[8]De Giusti VC，Caldiz CI，Ennis IL，et al.Mitochondrial reactive oxygen species（ROS）as signaling molecules of intracellular pathways triggered by the cardiac renin-angiotensinⅡ-aldosterone system（RAAS）[J].Front Physiol，2013，4：126-134.

[9]Li L，Shoji W，Oshima H，et al.Crucial role of peroxiredoxinⅢin placental antioxidant defense of mice[J].FEBS Lett，2008，5（82）：2431-2434.

[10]Matsushima S，Ide T，Yamato M，et al.Overexpression of mitochondrial peroxiredoxin-3 prevents left ventricular remodeling and failure after myocardial infarction in mice[J].Circulation，2006，1（13）：1779-1786.

[11]Wang YG，Li L，Liu CH，et al.Peroxiredoxin 3 is resistant to oxidation-induced apoptosis of Hep-3b cells[J]. Clin Transl Oncol，2014，16（6）：561-566.

[12]Hattori F，Murayama N，Noshita T，et al.Mitochondrial peroxiredoxin-3 protects hippocampal neurons from excitotoxic injury in vivo[J].J Neurochem，2003，86（4）：860-868.

Effect of Peroxiredoxin-3 on angiotensinⅡ-induced cardiomyocytes hypertrophy

ZHAO Xia1LIANG Tingting2PEI Qiang3WANG Hongbo4FANG Yulei2WEI Zhongqiu2FENG Li2SUN Ying2▲
1.Medical Research Center,Jitang College,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan063300,China;2.Department of Pathology,Primary Medicine College,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan063000,China; 3.Department of Cardiology,Zunhua People's Hospital,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan064200, China;4.Department of Surgery,Zunhua People's Hospital,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan 064200,China

Objective To study the effect of peroxiredoxin-3(Prdx-3,a noval type of peroxidase)on AngiotensinⅡ(AngⅡ)-induced cardiomyocytes hypertrophy and explore the precious mechanism.Methods Cultured cardiomyocytes (H9C2)were randomly divided into four groups:control group,AngⅡgroup,AngⅡ+vehicle(plasmid without prdx-3 gene)group,AngⅡ+Prdx-3 plasmid group.Prdx-3 was transfected into cardiomyocytes using the liposome infection. Western blot was used to evaluate Prdx-3 expression in cardiomyocytes,while levels of brain natriuretic peptide(BNP) mRNA and reactive oxygen species(ROS)were measured by Real-time PCR and DCFH-DA.Results The expression of Prdx-3 protein in transfected cardiomyocytes(0.88±0.12)was significantly higher than vehicle(0.38±0.05,P＜0.05). Compared with control group,expressions of BNP mRNA,ROS and Prdx-3 in AngⅡgroup all increased[(1.00±0.00) vs(1.72±0.29),(3473±81)vs(4439±111),(0.33±0.05)vs(0.72±0.14),P＜0.05].The difference of expressions of BNP mRNA[(1.72±0.29)vs(1.94±0.34)],ROS[(4439±111)vs(4285±167)]and Prdx-3[(0.72±0.14)vs(0.75±0.11)]between AngⅡand AngⅡ+vehicle groups were not statistically significant(P＞0.05).Compared with AngⅡ,expressions of BNP mRNA and ROS in AngⅡ+Prdx-3 plasmid group were lower[(1.72±0.29)vs(1.29±0.15),(4439±111)vs(3648± 254),P＜0.05],while Prdx-3 level was further higher[(0.72±0.14)vs(1.89±0.37),P＜0.05].Conclusion AngⅡinduced cardiomyocytes to generate ROS,which contributes to cell hypertrophy;however,Prdx-3 over-expression inhibits these changes by decreasing ROS level.

Peroxiredoxin-3;Reactive oxygen species; Cardiomyocytes hypertrophy;AngiotensinⅡ

R542.2

1673-7210（2015）07（c）-0018-04

2015-02-14本文编辑：程铭）

河北省引进留学人员科技活动项目（D2012003028）。

▲通讯作者