鬼针草等6味中草药复方制剂抑菌活性的初步研究

张雪梅,赵锦慧,张永亮

致病性大肠杆菌是导致动物患病的常见病原菌,常引起严重腹泻、败血症等多种疾病,治疗不及时常引起动物死亡[1,2].长期以来,虽然抗生素对细菌性感染疾病的治疗起主要作用,但随着抗生素逐渐更新换代及不合理应用,病原菌的耐药性日益增强,西药治疗效果逐步减退[3].中草药不仅可以通过提高机体的免疫力而增强机体对疾病的抵抗力,还较少产生抗药性和耐药性,对机体的毒害也相对较小,因此用作畜禽细菌性疾病的防治或畜禽饲料添加剂有很好的应用前景[4-6].通常具备清热解毒功效的中草药在体外大多显示一定的抗菌活性[7].本试验选取鬼针草等6种常见的清热解毒中草药,研究其复方中草药制剂对致病性大肠杆菌的体外抑菌活性,旨在为开发绿色、环保、抗菌中草药制剂及动物细菌性疾病的预防和治疗提供科学的理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

中药材:鬼针草、鼠曲草、鱼腥草、绞股蓝、牡丹皮、墨旱莲,购于周口市开心人大药店.

供试菌种:大肠杆菌,由周口师范学院生命科学与农学学院提供.

1.2 仪器和试剂

仪器:电热恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、电子天平等.

试剂:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、液体培养基(营养肉汤培养基).

1.3 方法

1.3.1 复方中草药提取液的制备[8,9]

第1组取鬼针草25 g,鼠曲草15 g,鱼腥草20 g;第2组取墨旱莲25 g,绞股蓝15 g,牡丹皮20 g.每组中各加入400 m L的蒸馏水,文火加热煮沸1 h,用纱布过滤后得提取液,滤渣用4倍水量煎煮2次后弃去,将3次所得滤液混合并浓缩到60 m L,使提取原液浓度达到1 g/m L.第3组取鬼针草25 g,鼠曲草15 g,鱼腥草20 g,绞股蓝15 g;第4组取鼠曲草15 g,绞股蓝15 g,牡丹皮20 g,墨旱莲25 g,同法将每组3次所得提取液浓缩至75 m L;第5组取鬼针草25 g,鼠曲草15 g,鱼腥草20 g,绞股蓝15 g,牡丹皮20 g;第6组取鼠曲草15 g,鱼腥草20 g,绞股蓝15 g,牡丹皮20 g,墨旱莲25 g,同法使每组的3次滤液浓缩至95 m L;第7组取鬼针草25 g,鼠曲草15 g,鱼腥草20 g,绞股蓝15 g,牡丹皮20 g,墨旱莲25 g,同法将3次所得滤液浓缩至120 m L.最终各组提取液浓度均为1 g/m L,所得提取液在121℃下高压蒸汽灭菌20 min后,4℃保存备用.

1.3.2 普通细菌培养基的制备

固体培养基:制备牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(营养琼脂培养基)[10].

液体培养基:制备营养肉汤培养基[11].

1.3.3 菌种活化及菌悬液的制备

在超净工作台上用无菌接种环从试管斜面上挑取大肠杆菌少许接种于营养琼脂培养基上,37℃活化培养24 h[12].挑取活化后的大肠杆菌的单个菌落放入无菌生理盐水中制备成菌悬液,调节菌液稀释度,用平板菌落计数法[13]测定其菌体密度,菌体密度达到102cfu/m L的菌悬液即为本试验合适的供试菌悬液.

1.3.4 抑菌率的测定

在超净工作台内,将经过加热熔化的营养琼脂培养基倒入无菌培养皿中,凝固成平板待用.将各组复方中草药提取原液与大肠杆菌菌悬液按比例混合配制混合液,使混合液中药液含量分别为500 mg/m L和250 mg/m L,分别取各种混合液0.2 m L,涂布平板,用无菌生理盐水做对照.将涂布好的平板放置30 min后倒置,然后放入37℃的恒温培养箱中培养24 h后统计菌落个数,计算抑菌率.[14].涂布平板时每种药液稀释度设置5个重复,抑菌率用5次重复的平均值表示.

1.3.5 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

采用二倍稀释法[15,16],将7组复方中草药提取液分别用营养肉汤培养基稀释,稀释后的药液培养基浓度分别为500 mg/m L,250 mg/m L,125 mg/m L.MIC的测定:在装有1 m L药液培养基的各管中加入0.1 m L的菌悬液(菌悬液的菌体密度为102cfu/m L),混匀,37℃恒温条件下培养24 h后观察结果,以试管中无浑浊现象出现的最低药液浓度作为MIC,实验设置对照管.MBC的测定:在MIC测定的基础上,从未见细菌生长的各管培养物中吸取0.1 m L涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上,37℃条件下培养24 h,观察结果,以仍无细菌生长的管内药物浓度记为该药物的MBC.

1.3.6 药敏纸片法测抑菌圈直径

中草药提取液抑菌圈测定采用药敏纸片法[17],选取吸水性较好的滤纸,用打孔器制成直径为6 mm的圆形滤纸片,高压蒸汽灭菌后备用.在超净工作台上将熔化后的营养琼脂培养基倒平板,每皿大约15～20 m L,凝固后备用.用无菌吸管吸取0.1 m L菌悬液滴入备好的平板中,用涂布棒将菌悬液涂布均匀.将制备好的圆形滤纸片在各组复方中草药提取原液(浓度为1 g/m L)中浸泡1 h,用无菌镊子夹取浸透药液的滤纸片,沥去多余的药液后将其贴于上述制备好的含菌平板上,每个平板上贴5片,并用无菌生理盐水做对照,然后将平板置于37℃恒温箱中培养24 h,培养结束后测量抑菌圈直径,比较各组的抑菌效果.

药敏纸片法可参考以下标准记录结果:抑菌圈直径为16～20 mm,表示高度敏感;11～16 mm,表示中度敏感;10～11 mm表示轻度敏感;＜10 mm,表示不敏感.

2 结果与分析

2.1 7组复方中草药提取液对大肠杆菌的抑菌率

表1 不同浓度的复方中草药提取液对大肠杆菌的抑菌率统计结果

7组复方中草药提取液在不同浓度下对大肠杆菌的抑菌率统计结果见表1.由表1可知:7组复方中草药提取液在不同浓度下对大肠杆菌均有不同程度的抑制作用.第1组、第2组、第4组、第5组、第6组随提取液浓度的增加,抑菌率呈上升趋势;第3组、第7组随提取液浓度的增加,抑菌率呈下降趋势.当提取液浓度为500 mg/m L时,第4组和第6组的抑菌率均达到90%以上;当提取液浓度为250 mg/m L时,第3组的抑菌率达到90%以上.上述结果表明,不同中草药配伍对大肠杆菌的抑制效果不同,但复方中草药提取液浓度与抑菌效果之间并非正相关,有些复方中草药在低浓度下反而对大肠杆菌抑制效果好.

2.2 7组复方中草药提取液对大肠杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

表2 不同浓度的复方中草药提取液作用下大肠杆菌的生长情况

表3 7组复方中草药提取液对大肠杆菌的最小抑菌浓度与最小杀菌浓度

在不同浓度的复方中草药提取液作用下大肠杆菌的生长情况见表2.从表2可以看出,第1组、第2组、第5组在3个浓度下,大肠杆菌均有生长,第4组、第6组在500 mg/m L的浓度下,试管内无浑浊现象,第3组在250 mg/m L和125 mg/m L的浓度下,试管内均无浑浊现象,第7组在125 mg/m L的浓度下,试管内无浑浊现象.这说明第1组、第2组、第5组对大肠杆菌抑制效果较差,第4组、第6组在高浓度下对大肠杆菌抑制效果较好,而第3组、第7组在低浓度下对大肠杆菌抑制效果较好.此研究结果与上述抑菌率统计结果相似.最小抑菌浓度的测定,也能在一定程度上反映7组不同的中草药配伍对大肠杆菌的抑菌性能.

从MIC测定中试管内无浑浊现象出现的各管中吸取0.1 m L培养物涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上,37℃条件下培养24 h后,观察结果见表3.由表3可知,第3组、第7组的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均为125 mg/m L,剩余几组平板上仍然有大肠杆菌生长.

2.3 7组复方中草药提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径

7组复方中草药提取液在1 g/m L浓度下对大肠杆菌的抑菌圈直径统计结果见表4.由表4可知:7组复方中草药提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径各不相同,大肠杆菌对第4组、第6组复方中草药提取液表现中度敏感,对第1组、第2组复方中草药提取液表现轻度敏感,对第3组、第5组、第7组复方中草药提取液表现不敏感.这与上述抑菌率、最小抑菌浓度研究结果基本一致.

表4 7组复方中草药提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径统计结果

3 讨论

本实验结果表明,不同中草药配伍对大肠杆菌的抑菌、杀菌效果不同,同一种中草药配伍下,复方中草药提取液浓度对抑菌效果影响明显.第1组、第2组、第5组对大肠杆菌抑制效果较差,第4组、第6组在高浓度下对大肠杆菌抑制效果较好,第3组、第7组在低浓度下对大肠杆菌抑制效果较好.

7组复方中草药提取液对大肠杆菌均有不同程度的抑制作用,但其抑菌、杀菌效果有明显差异.其原因可能有以下几个方面:①中草药中能够抑菌的有效成分主要是各种精油、酚类、生物碱和黄酮类等物质[18],中草药所含的有效成分不同决定了其抑菌效果;②多种药物联合使用后,药物中能够抑菌的有效成分增多,可能就会使抑菌效果增强[19];③不同中草药含有的有效成分对菌体的作用机制有差异,他们可能会作用于细菌生长的不同阶段,所以复方中草药制剂可以发挥综合调控的作用[20];④不同中草药之间可能会发生一些化学反应改变某些有效抑菌成分,从而导致复方中草药制剂抑菌效果减弱;⑤不同中草药配伍后,并不是所选用的药物浓度越高抑菌效果就越好,可能是各种有效抑菌成分之间存在合适配比的问题.

目前对于单味中草药抑菌效果研究较多[2123],但对于复方中草药制剂抑菌性能及抑菌机理方面的研究比较少[24].因此,绿色环保抗菌中草药复方制剂有非常广泛地研究、开发和利用前景.

每种中草药由于其来源、季节性变化、植物部位、提取方法不同均会影响其抑菌效果,多种中草药配伍后,其抑菌性能的影响因素更加复杂,这为开发与研制复方中草药杀菌剂带来了一定的难度,因此需要进行更多地研究.

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