一种检测食品中细菌总数的显色纸片的制作方法

胡元森，王玉利，吕扬勇，雷 阳，陈 静，李翠香

（河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001）

0 前言

由细菌引起的食源性传染病及食物中毒事件占整个食品安全事件的80%以上[1-2]，食品中细菌数量及种类是评价食品安全性的重要指标之一[3-4].近些年，国内外发展了一些食品中的微生物检测方法，如测试片技术[5]、生物电化学技术[6]、免疫学方法[7]、生物发光技术[8]等，这些方法技术先进，但检测需要精密仪器，检测成本高，难以在生产中推广.现有食品菌落总数检测采用的国标方法程序烦琐，检测时间长，在多个环节容易影响检测结果[9-10].因此，发展简便、快捷、经济的细菌检测方法十分重要.

快速检测试纸片是一种预先制备好的一次性培养基制品，含有微生物生长所需营养基质及脱氢酶指示剂，能使菌体在测试片上呈红色而增强计数效果[11].目前，国内外已有类似的产品，应用最多的检测试纸片为3M 公司生产的petrifilm 系列检测纸片，但该产品价格较高，在国内不能得到广泛应用.国内也出现了多种快速检测纸片，但产品均有需改进之处，如涂布不匀、吸水性和保湿性差、菌体显色不完全等[12-13].

作者从载体和培养基、固着剂及显色剂TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）浓度、片基烘干温度及时间等方面对显色纸片的制作进行了研究，建立了一种可用于检测食品中细菌总数的显色纸片的制作方法.本显色纸片制作和使用简单、显色快速、价格低廉，可在一般实验室推广应用，具有良好的发展前景.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 微生物菌株

大肠埃希氏菌（Escherich coli）为本实验室保藏菌株，无致病性.

1.1.2 培养基

LB 培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L.

1.1.3 主要化学试剂

TTC：国药集团化学试剂有限公司；琼脂糖、明胶等均为国产，分析纯.

1.2 方法

1.2.1 显色纸片制作流程

显色纸片的一般制作流程为：选取显色纸片片基→确定最佳营养基质→确定营养基质的固着剂→确定最佳显色物质浓度→将含最佳固着剂、显色物质的营养基涂布于显色纸片片基上→确定最佳干燥条件→效果检测.

1.2.2 显色纸片片基的选择

显色纸片片基需具有良好的吸水性、热稳定性、孔隙均匀等特点.选取硝酸纤维素膜、纯木棉纸和定性滤纸作为显色纸片的片基，将1 mL 的大肠杆菌菌悬液滴在直径为9 cm 的上述3 种片基上，涂布均匀，观察3 种片基的吸水速度.然后将该片基置于80 ℃烘箱干燥30 min，观察其变形情况.

1.2.3 显色纸片培养基固着剂的选择

分别制备含8%明胶、1.5%琼脂糖和1%硅胶的LB 半固体培养基，将片基在各培养基中浸泡5 min 后取出，于80 ℃烘箱干燥，然后滴加1 mL 大肠杆菌悬液，于37 ℃培养.观察3 种固着剂纸片的吸水情况及菌体培养后的显色情况.

1.2.4 明胶浓度的确定

明胶浓度会影响显色纸片的吸水性、保湿性及菌落形成速度，进而影响样品检测效果.分别考察培养基中添加6%、8%、10%、12%、14%和17%的明胶对显色纸片制作及大肠杆菌生长的影响.

1.2.5 TTC 浓度的确定

培养基中TTC 浓度高低会影响细菌菌落颜色深浅和菌落生长速度.试验分别考察了向培养基添加0.005%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和0.05%的TTC 时显色纸片对大肠杆菌的培养显色效果.

1.2.6 显色纸片烘干温度和时间的确定

按前述已确定的最佳培养基、固着剂浓度、TTC 添加量等，制备显色纸片.然后将片基在85 ℃下干燥，干燥时间为10、20、25、30 和35 min，然后考察该显色纸片对大肠杆菌的检测效果，确定最佳烘干温度和时间.

1.2.7 显色纸片的稳定性

制备显色纸片后，分别在室温光照处、45 ℃培养箱、25 ℃黑暗避光处放置4 d 和30 d，以及在40 W 紫外灯下20 cm 处放置4 h 时.取出后，在其上滴加大肠杆菌菌悬液，37 ℃培养，观察大肠杆菌的培养效果.

1.2.8 显色纸片与国标法检测细菌的效果比较

将已培养好的大肠杆菌菌液进行梯度稀释制备菌悬液.同时取鲜肉25 g，切碎，匀浆，制成合适浓度的样品悬液.分别用显色纸片及国标法对大肠杆菌稀释液及鲜肉样品稀释液进行菌落计数，比较两者计数结果的差异.

2 结果与分析

2.1 显色纸片片基的选择

研究了硝酸纤维素膜、木棉纸和定性滤纸为片基制作显色纸片的效果，结果见图1.由图1 可见，在加入大肠杆菌菌悬液时，菌悬液在木棉纸片和定性滤纸上能够均匀地扩散并在1 min 内被完全吸收.硝酸纤维素膜吸水能力较差，菌悬液在其表面积存.将3 种片基进行热稳定性测试，结果发现，硝酸纤维素膜颜色变黄，定性滤纸发生皱折现象，而木棉纸稳定性较好，没有明显的皱缩现象.因此，选取木绵纸为显色纸片的片基.

图1 显色纸片片基的吸水性与热稳定性Fig.1 Water absorption and heat stability of colordeveloping test paper

2.2 显色纸片培养基固着剂的确定

培养基固着剂可将营养基质固着在纸片片基上，同时保持菌体生长所需充足水分.试验中发现，硅胶吸水能力较强，但溶解性差，不能使培养基黏附于片基上.琼脂糖可增加培养基黏着力，但制作的纸片培养基吸水效果差.添加明胶的片基干燥后与培养皿紧贴，不发生形变，且能在1～2 min 使1 mL 的菌液完全吸收.图2 显示，添加琼脂糖的纸片培养基上长出的菌落弥散，有拖尾现象，计数困难，在添加有明胶的培养基纸片上菌落形成较好，菌落分布相对均匀.

图2 试纸片上固着剂的选择Fig.2 Fixing agent selection of test paper

2.3 显色纸片中明胶浓度的确定

图3 显示，培养基中添加6%～17%的明胶对大肠杆菌的生长均无明显影响.但当明胶浓度过高时，其对滴加于纸片上的水分吸附力增强，培养后菌落生长过于集中，菌落小，不易观察；当明胶浓度较低时，菌悬液扩散太快，菌落形成聚集，影响菌落计数.当明胶浓度为12%时，水分扩散速度适中，菌悬液涂布后，能在整个基面均匀分布，菌液吸收完全，培养后菌落形成较好，容易观察（图3-D）.

图3 培养基中明胶浓度的确定Fig.3 Determination of the concentration of gelation in the medium

2.4 纸片显色培养基中TTC 浓度的确定

TTC 浓度偏低时，菌体显色不完全；浓度过高时，则抑制菌体生长.以大肠杆菌为测试菌株，研究了显色纸片中TTC 浓度对检测效果的影响，结果见图4.由图4 可见，TTC 浓度为0.005%和0.01%时，菌落显色较浅，浓度为0.02%时菌落能够形成，且红色较明显.随着TTC 浓度增加，菌落生长及显色没有明显改善.因此，0.02%的TTC 浓度较为适宜.

图4 培养基中TTC 浓度对大肠杆菌生长的影响Fig.4 Effect of TTC concentration on the growth of Escherichia coli in the medium

2.5 显色纸片干燥时间的确定

纸片显色制作时需进行干燥处理，将浸泡过培养液的片基放在高温下干燥，考察干燥时间对显色纸片的影响，结果见图5.由图5 可见，85 ℃处理10 min，纸片培养基即可被烘干，延长时间并没有改善培养效果，用90 ℃以上的高温处理片基时容易使之变黄，影响后续试验观察.因此，确定纸片干燥温度为85 ℃，干燥时间为10 min.

图5 片基最佳干燥时间确定Fig.5 Determination of the optimum paper drying time

2.6 利用显色纸片检测细菌的效果

分别用显色纸片法与LB 培养基稀释平板涂布法测定3 个稀释度的大肠杆菌悬液，结果见图6.结果显示，两种方法培养获得的菌落数目相当，差异不明显.但当用显色纸片培养约16 h，大肠杆菌红色菌落清晰可见，继续培养菌落数量不再增加.而在LB 培养基上，37 ℃培养24 h 以上才可看到明显的菌落.这一结果表明，显色纸片与LB 培养基检测细菌的结果具有一致性，但其检测时间大幅缩短.

图6 显色纸片与LB 培养基测定大肠杆菌菌落数Fig.6 Determination of the total count of Escherichia coli by test paper and LB medium

用LB 培养基和显色纸片分别测定鲜肉中的带菌量，结果见图7.结果表明，两种培养法获得的细菌数量在各稀释度均较为一致，表明可用本法制备的显色纸片替代常规细菌平板计数中的LB培养基进行食品细菌数量的测定.

图7 显色纸片与LB 培养基测定鲜肉中细菌总数Fig.7 Determination of the total count in freshmeat by test paer and LB medium

2.7 显色纸片稳定性研究

考察了显色纸片在光照、高温、紫外辐照等条件下的稳定性，结果见图8.图8 显示，在光照处理后，由于显色剂TTC 见光分解导致显色纸片显红色，菌体生长时菌落颜色显色不够（图8-A），光照时间越长，TTC 分解越多，纸片本底红色愈强（图8-A，图8-B）.显色纸片在常温和45 ℃高温避光存放30 d，两者对同一样品检测到的细菌数量相当，45 ℃高温处理后，显色纸片上细菌生长菌落较小，菌落颜色也不明显（图8-C,图8-D），说明高温处理对纸片显色培养基及显色剂均有不利影响.同时发现，短时间紫外光照对显色纸片的检测效果没有影响（图8-E）.这一结果说明本显色纸片受温度影响不大，但应避光保存.

图8 不同条件对试纸显色培养基稳定性的影响Fig.8 Effect of different conditins on the stability of color-developing test paper medium

3 结论

研究了一种可用于检测食品中细菌总数的显色纸片的制备方法，该显色纸片以木棉纸为片基，以12%明胶为营养基固着剂，以LB 培养液为营养基质，在营养基质中添加TTC 作为显色剂，其最佳终浓度为0.02%，在85 ℃烘箱中干燥10 min 即可.本显色纸片避光保存时的储藏稳定性较好.

用本文所制作的显色纸片与用传统的稀释平板涂布进行菌落计数检测的结果具有一致性.本显色纸片在培养约16 h 就能看到明显的红色菌落，较传统平板培养肉眼可见菌落缩短了8～12 h.本显色纸片制作和使用简便、显色明显、计数效果好，便于推广.

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