固相萃取和同位素内标法检测白酒中氨基甲酸乙酯

王 健，艾涛波，岳清洪

（四川省食品药品检验检测院（东区），四川成都，610100）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）具有致癌作用，如今被广泛用于工业涂料及动物麻醉[1-2]。研究发现，氨基甲酸乙酯也是发酵食品（如酱油、酵母、奶酪）和酒精饮料（如黄酒、白酒、葡萄酒）的副产物[3-6]。而白酒作为一种深受我国大众喜爱的酒精饮料，市场规模庞大，有报道称[7-8]，中国白酒到2016年将占到全球烈酒消费量的近50%，因而针对氨基甲酸乙酯残留量的测定对于我国食品安全和公众健康都有着极为重要的意义。

目前关于食品氨基甲酸乙酯的检测，我国仅有进出口商品检验行业标准SN/T 0285—2012《出口酒中氨基甲酸乙酯残留量检测方法气相色谱-质谱法》[9]以及吉林省地方标准DBS 22/011—2013《饮料酒中氨基甲酸乙酯的测定气相色谱-质谱法》[10]，而氨基甲酸乙酯的食品安全国家标准尚处于征求意见阶段。SN/T 0285—2012先采用二氯甲烷液液萃取，然后用正己烷和PSA净化后进行分析，该方法操作费时繁琐，且回收率不稳定。DBS 22/011—2013和食品安全国家标准（非正式文本）均采用固相萃取技术，方法简便易操作，但洗脱时采用的乙醚属于易制毒试剂，购买比较麻烦[11-12]。本实验采用氨基甲酸乙酯专用固相萃取柱对酒中的氨基甲酸乙酯进行提取净化，同位素内标法进行定量[13]，样品处理步骤简单迅速，无需其他除杂过程（如正己烷淋洗小柱），且二氯甲烷用量较少，不使用乙醚，采用同位素内标法也可以避免前处理造成的误差，方法具有较高的灵敏度和准确度，在国家标准之外，可供各检测机构参考用于白酒氨基甲酸乙酯检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈（色谱纯）、二氯甲烷（色谱纯）：美国Sigma公司；无水硫酸钠（分析纯）；D5-氨基甲酸乙酯标准品（纯度99.6%）：加拿大CDN ISOTOPES公司；氨基甲酸乙酯标准品（纯度99.7%）：美国AccuStandard公司；氨基甲酸乙酯专用固相萃取柱（Cleanert EC-SPE购于Agela，4 g/25 mL）。白酒：市售。

1.2 仪器与设备

6890N/5973i气相色谱质谱仪：美国安捷伦公司；FA2004N分析天平（感量0.000 1 g）：上海菁华公司；Laborota 4000旋转蒸发仪：德国heidolph海道夫公司；DragonLab MX-S漩涡混合器：深圳良谊公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

内标（D5-氨基甲酸乙酯）溶液的配制：准确称取约10 mg（精确至0.000 1 g）D5-氨基甲酸乙酯标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到质量浓度为100 μg/mL的内标储备液。取上述储备液1 mL用乙腈定容至100 mL，得质量浓度为1 μg/mL的内标使用液，于4 ℃冰箱内保存。

标准曲线的绘制：准确称取约10 mg（精确至0.000 1 g）氨基甲酸乙酯标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到质量浓度为100 μg/mL标准储备液。再取上述储备液1 mL用乙腈定容至100 mL，得质量浓度为1 μg/mL的标准使用液。用乙腈逐级稀释使用液，并加入内标，得到质量浓度为0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL（其中内标D5-氨基甲酸乙酯质量浓度为0.2 μg/mL）的标准溶液，用于绘制标准曲线。

1.3.2 气相色谱-质谱操作条件

气相色谱（gas-chromatography，GC）条件：毛细柱HP-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度230 ℃；载气：高纯氦气；流速1 mL/min；程序升温：60 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min速率升至150 ℃，保持1 min；使用不分流进样，进样量为1 μL。

质谱（mass spectrometry，MS)条件：接口温度为240 ℃；电离方式为电子电离源（electron ionization，EI）；电子能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；四级杆温度为150 ℃；扫描模式为单离子检测扫描（single ion monitoring，SIM）；氨基甲酸乙酯监测离子：62，74，89，其中定量离子为62；D5-氨基甲酸乙酯监测离子：64，76，89，其中定量离子为64；溶剂延迟时间为13.5 min。

1.3.3 样品处理

称取4 g 白酒于50 mL 样品瓶中，加入内标0.4 mL，涡旋混合均匀，将样品加入氨基甲酸乙酯专用净化柱上，静置10 min以保证样品和填料充分湿润（可用真空泵施加负压以利于填料的吸收）。用20 mL二氯甲烷分两次洗脱，鸡心瓶收集洗脱液，将洗脱液在40 ℃条件下真空旋转蒸发至近干，用2 mL乙腈洗涤鸡心瓶，随后加入少量无水硫酸钠，静置片刻，用有机相滤膜进行过滤，取少量入进样瓶，使用上述仪器条件上机检测。

1.3.4 样品定性与定量

质谱仪进行测定，在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子全部出现，同时所选择的离子丰度比与标准品相关离子的相对丰度一致，且波动范围在容许偏差之内，可判定样品中存在氨基甲酸乙酯。用内标法计算样品中氨基甲酸乙酯的浓度。

2 结果与分析

2.1 实验结果

在上述色谱柱和色谱条件下，氨基甲酸乙酯与内标分离效果好，峰形对称，灵敏度高。氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的总离子流图如图1所示。氨基甲酸乙酯的保留时间为14.12 min，D5-氨基甲酸乙酯的保留时间为14.03 min，两者的保留时间较接近，定量离子无干扰。分别提取氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的定量离子62和64，其定量离子色谱图见图2。氨基甲酸乙酯的质谱图见图3，D5-氨基甲酸乙酯的质谱图见图4。

图1 氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的总离子流图Fig.1 Total ion chromatorgraphy of ethyl carbamate and D5-ethyl carbamate

图2 D5-氨基甲酸乙酯(A)和氨基甲酸乙酯(B)的定量离子色谱图Fig.2 Quantitative ion chromatography of D5-ethyl carbamate (A)and ethyl carbamate (B)

图3 氨基甲酸乙酯质谱图Fig.3 Mass spectra of ethyl carbamate

图4 D5-氨基甲酸乙酯质谱图Fig.4 Mass spectra of D5-ethyl carbamate

2.2 标准曲线及方法检出限

将配制的标准溶液在设置好的仪器条件下进行检测，然后绘制标准曲线，得到的线性方程为y=6.003x+5.692E-003（相关系数为0.999），其中x为峰面积，y为目标物质量分数（μg/g），根据标准品最低浓度色谱图的信噪比S/N=3计算，此方法检出限为1 μg/kg。

2.3 加标回收率及精密度

向酒样中添加适量的标准溶液，每个质量浓度水平下做6次平行实验，测定加标回收率，平均回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表1。由表1可知，本方法具有较好的精密度和回收率，可以满足测定要求，样品中有少量的氨基甲酸乙酯检出，故加标样品本底为阳性样品。白酒样品色谱图见图5，白酒样品加标色谱图见图6（加标质量浓度为0.25 μg/mL）。

表1 白酒加标回收率及精密度Table 1 The recovery rate and precision of liquor

图5 白酒样品色谱图Fig.5 Chromatogram of Chinese liquor sample

图6 白酒样品加标色谱图Fig.6 Chromatogram of Chinese liquor with standard substance

3 结论

实验结果表明，使用该氨基甲酸乙酯专用固相萃取柱和同位素内标法检定白酒中氨基甲酸乙酯能有较好的稳定性和回收率，该方法对二氯甲烷的需求量也不高，在做好检验员防护的情况下，也是较为安全的。同时，该氨基甲酸乙酯专用柱具有一定的除杂能力，对白酒中的氨基甲酸乙酯能有较高的灵敏度，快速、简便，可应用于大批量样品的前处理。

利用该方法随机抽取市面上销售20种白酒产品，氨基甲酸乙酯检出率为92.1%，含量约为0.01～0.2 μg/g，和国内文献报道的结果一致[14-16]。

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