紫色胡萝卜汁体外抗氧化活性的研究

虎春艳，林玉萍，鲁 瑞，张春梅，罗兴倩，梁 杏，赵声兰*

（1.云南中医学院 药学院，云南 昆明 650500；2.云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650500）

萝卜是常见蔬菜之一，《本草纲目》记载，“萝卜大下气、消谷和中、去邪热气”。其种类有胡萝卜、白萝卜、水萝卜、樱桃萝卜等，紫色胡萝卜和橙色胡萝卜是胡萝卜中的两个种类，由于其丰富的营养价值，在北欧等地被广泛种植[1]。紫色胡萝卜富含花青素、β-胡萝卜素、多酚、维生素等物质，此外还含有丰富的钾、镁、钙等矿物质元素。紫色胡萝卜中所含的花青素主要是酰化花青素，其含量占花青素的70%以上，酰化花青素具有较高的稳定性和更好的生物活性[2]。花青素具有抗癌、抗炎、抗氧化及减少动脉粥样硬化等作用[3-5]。人体新陈代谢过程中产生超氧自由基、羟自由基等自由基，这些自由基是很多生理和病理疾病的积极参与者[6]。国内外研究表明，部分植物果实、蔬菜及其提取物具有较强的清除自由基、延缓机体衰老的作用[7-9]。

我国大部分地区种植白萝卜、橙色胡萝卜和紫色胡萝卜，其中紫色胡萝卜在我国滇东北地区广泛种植。国内对橙色胡萝卜和白萝卜研究较多，白萝卜具有较好的清除亚硝酸盐的作用[10]，胡萝卜中的多糖具有抗氧化活性[11]，萝卜籽提取物还有较好的抑菌效果[12]，而紫色胡萝卜其极高的营养价值一直没有被大众所认识。国外大量种植紫色胡萝卜，将其作为一种良好的保健食品[2，4]，尤其是紫色胡萝卜汁深受大众喜爱。本实验研究了紫色萝卜汁的体外抗氧化作用，为紫色胡萝卜的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫色胡萝卜、橙色胡萝卜、白萝卜：购买自云南省昭通市。

硫酸亚铁、邻菲啰啉、过氧化氢30%、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、焦性没食子酸、三（羟甲基）氨基甲烷、邻苯三酚、无水乙醇、硫酸、盐酸、福林酚、无水碳酸钠、氯化钾、醋酸钠、冰乙酸等均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

UV759s型紫外-可见分光光度计：上海精科实业有限公司；CP214型号电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；TG16-WS高速台式离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；H.H.S11-4R型电热恒温水浴锅：上海医疗器械五厰；HR2826型飞利浦榨汁机：珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萝卜汁的制备

紫色胡萝卜洗净去芯，压榨取汁，汁液在离心机中4 000 r/min离心15 min，取上清液，备用。

白萝卜和橙色胡萝卜直接洗净榨汁，4 000 r/min离心处理15 min，取上清液，备用。

1.3.2 紫色胡萝卜总酚含量测定

采用Folin-酚法，按文献[13]测定总酚含量。配制质量浓度分别为10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的没食子酸工作液，分别精密吸取上述没食子酸工作液1 mL，加入10 mL 的具塞试管内，加入10%Folin-酚试剂5 mL，5～8 min后加入4 mL 7.5%的Na2CO3溶液，蒸馏水定容至25 mL，充分摇匀，避光静置反应2 h，在波长765 nm处测定吸光度值，以没食子酸质量浓度为横坐标（x），以吸光度值为纵坐标（y），制作标准曲线，得回归方程：y=0.011 4x+0.018 9（r=0.999 1），该标准曲线线性范围为吸光度值0～0.915 3。

25 mL具塞试管中加入稀释的紫色胡萝卜汁1 mL，加入10%Folin-酚试剂5 mL，按上述方法测定紫色胡萝卜汁溶液的吸光度值，通过没食子酸标准曲线计算样品的总酚含量。

1.3.3 紫色胡萝卜总花青素含量的测定

采用pH示差法，按文献[14]测定紫色胡萝卜中花色苷的含量。取0.025 mol/L、pH 1.0的HCl-KCl缓冲溶液和0.4 mol/L、pH 4.5 HAc-NaAc缓冲溶液各4.5 mL，分别加入待测样品0.5 mL，在暗处放置30 min，分别测定两样品在波长510 nm和700 nm处的吸光度值。按下式计算稀释液吸光度值A。

式中：（A510nm-A700nm）pH1.0为样品在pH 1.0的缓冲液中在波长510 nm和700 nm处的吸光度值之差；（A510nm-A700nm）pH4.5为样品在pH 4.5的缓冲液中在波长510 nm和700 nm处的吸光度值之差。待测样品中花色苷的含量为：

式中：C为待测样品中花色苷的含量，mg/L；MW为样品中主要花色苷矢车菊-3-葡萄糖苷的相对分子质量，为449.2；DF为稀释因子；ε为样品中主要花色苷的的摩尔吸收率，为26 900；l为比色杯厚度，cm。

1.3.4 不同稀释倍数的萝卜汁对·OH的清除作用

羟自由基清除率的测定方法参考文献[15]进行，以不同质量浓度的维生素C为阳性对照，分别在10 mL具塞试管中加不同浓度的萝卜汁0.1 mL，依次加入0.75 mmol/L FeSO41 mL，0.75 mmol/L邻二氮菲1 mL，最后加入0.01%H2O21 mL，37 ℃保温1 h，以4 mL蒸馏水调零。空白管用0.1 mL蒸馏水代替萝卜汁，1 mL蒸馏水代替0.01%H2O2，损伤管用0.1 mL蒸馏水代替萝卜汁，样品空白用1 mL蒸馏水代替0.01%H2O2。·OH清除率计算公式如下：

式中：A0为空白管的吸光度值；A1为损伤管的吸光度值；A2为样品空白管的吸光度值；A3为样品对照管的吸光度值。

1.3.5 不同稀释倍数的萝卜汁对H2O2的清除作用

测定方法参考文献[15]，以不同浓度的维生素C为阳性对照，分别在25 mL具塞试管中加不同质量浓度的萝卜汁0.5 mL，加入40 mmol/L H2O22.5 mL，加入7 mL蒸馏水，室温反应10 min后在波长230 nm处测定吸光度值。空白组用0.5 mL蒸馏水代替紫色胡萝卜汁，样品空白用2.5 mL蒸馏水代替H2O2。H2O2清除率计算公式如下：

式中：A0为不加萝卜汁的吸光度值；A1为样品对照组的吸光度值，即加萝卜汁又加40mmol/LH2O2；A2为不加40mmol/L H2O2的吸光度值。

1.3.6 不同稀释倍数的萝卜汁对O2-·的清除作用

采用邻苯三酚自氧化法产生O2-·，以不同质量浓度的维生素C为阳性对照，添加不同稀释倍数的萝卜汁进行清除，测定方法参考文献[16]，并略做修改。10 mL具塞试管中加入1.5 mL 0.05 mol/L pH 8.2 的Tris-HCl缓冲溶液，1.5 mL蒸馏水，摇匀，25 ℃水浴中保温20 min，取出后立即加入25 ℃预热3 mmol/L邻苯三酚0.3 mL，空白管用10 mmol/L的HCl代替邻苯三酚，迅速摇匀后倒入比色杯中，在波长325 nm处测定吸光度值，计算线性范围内每1 min吸光度值的增加值，即为邻苯三酚的自氧化速率ΔA对照。测定待测样品时加入邻苯三酚前先加入1.5 mL不同稀释倍数的萝卜汁，同时减少同体积的蒸馏水，其余操作同上，测出ΔA样品。超氧阴离子的清除率计算公式如下：

按上式计算出超氧阴离子的清除率。

2 结果与分析

2.1 紫色胡萝卜汁总酚和花青素含量的测定结果

2.1.1 紫色胡萝卜汁总酚含量的测定

根据1.3.2的方法，测定吸光度值，利用没食子酸标准曲线计算紫色胡萝卜总酚含量，结果见表1。紫色胡萝卜汁中，总酚含量为23.90 mg/mL。

表1 紫色胡萝卜汁总酚含量测定Table 1 Determination of total phenolic contents of purple carrot juice

2.1.2 紫色胡萝卜汁花青素含量的测定

根据1.3.3的方法，测定了不同稀释倍数紫色胡萝卜汁中花青素的含量，结果见表2。紫色胡萝卜中花青素的含量为287.62 mg/L。

表2 紫色胡萝卜汁花青素含量测定Table 2 Determination of anthocyanin content of purple carrot juice

2.2 不同稀释倍数的萝卜汁对·OH的清除率

不同稀释倍数的萝卜汁对·OH的清除率见图1。由图1（A）可知，萝卜汁稀释后，还原能力逐渐降低。加入相同体积和相同稀释倍数的萝卜汁时，紫色胡萝卜汁表现出了较强的抗氧化活性，橙色胡萝卜汁次之，白萝卜汁最低。紫色胡萝卜原汁对·OH的清除率为97.75%，橙色胡萝卜原汁78.67%，白萝卜原汁仅为35.10%。稀释倍数为5倍时，紫色胡萝卜汁清除率可达50%以上，橙色萝卜汁和白萝卜汁均低于20%。

图1（B）为不同质量浓度的维生素C对羟自由基的清除率，在1 000～4 200 mg/L质量浓度范围内线性回归方程为：y=16.059x+0.132 5（R2=0.999 5）。从图1可看出，稀释5倍的紫色胡萝卜汁对·OH的清除率为50%，相当于质量浓度为3 100 mg/L的维生素C对·OH的清除率，IC50为3 100 mg/L。可见，紫色胡萝卜汁对·OH具有较强的清除能力。

图1 0.1 mL不同稀释倍数萝卜汁(A)和不同质量浓度维生素C(B)对·OH的清除率Fig.1 The scavenging activity of 0.1 ml different dilution radish juice(A) and different concentrations of vitamin C (B) on·OH

2.3 不同稀释倍数的萝卜汁对H2O2的清除率

图2 0.5 mL不同稀释倍数萝卜汁(A)和不同质量浓度维生素C(B)对H2O2的清除率Fig.2 The scavenging activity of 0.5 ml different dilution radish juice(A) and different concentrations of vitamin C (B) on H2O2

不同稀释倍数的萝卜汁对H2O2清除率见图2。由图2（A）可知，稀释倍数越大，其对H2O2的清除率越低，随着萝卜汁浓度的增加，其对H2O2的清除率也逐渐增加。紫色胡萝卜汁对H2O2的清除率比橙色和白色萝卜汁的清除率都高，当稀释倍数为50倍时，紫色胡萝卜汁的清除率27.3%，橙色胡萝卜汁的清除率11.06%，白色胡萝卜汁清除率仅为8.06%，当稀释倍数为8倍时，紫色胡萝卜汁的清除率达92.7%，远高于橙色胡萝卜汁和白萝卜汁的清除率。

图2（B）为0.5 mL不同质量浓度的维生素C对H2O2的清除率，在400～900 mg/L质量浓度范围内其线性回归方程为：y=116.32x-27.225（R2=0.995 5），IC50为664 mg/L，当质量浓度为900 mg/L时，其清除率为75.1%。实验结果表明，稀释15倍的紫色胡萝卜汁对H2O2的清除率为56%，相当于700 mg/L的维生素C的清除率。

2.4 不同稀释倍数的紫色胡萝卜汁对超氧阴离子清除率

不同稀释倍数的紫色胡萝卜汁对超氧阴离子清除率见图3。由图3（A）可知，当加入紫色胡萝卜汁的量为1.5 mL时，稀释12倍的紫色胡萝卜汁对超氧阴离子清除率是96.3%。在稀释倍数为12～30的范围内，紫色胡萝卜汁随着稀释倍数的增加，其对O2-·的清除率逐渐减弱。橙色胡萝卜汁及白萝卜汁对超氧阴离子的清除率几乎为0。

图3 1.5mL不同稀释倍数紫色胡萝卜汁(A)和不同质量浓度维生素C(B)对O2-·的清除率Fig.3 The scavenging activity of 1.5 ml different dilution radish juice(A) and different concentrations of vitamin C (B) on O2-·

图3（B）为不同质量浓度的维生素C对O2-·的清除率曲线，在20～80 mg/L质量浓度范围内线性回归方程为：y=1 770.0x-12.932（R2=0.999 6），IC50为35.6 mg/L。稀释20倍的紫色胡萝卜汁对O2-·的清除率相当于40 mg/L的维生素C对O2-·的清除率。

3 结论

研究了紫色胡萝卜汁体外对·OH、H2O2和O2-·的清除作用，并与橙色胡萝卜汁和白萝卜汁进行对比。结果表明，紫色、橙色胡萝卜汁及白萝卜汁都具有体外抗氧化活性，紫色胡萝卜汁表现出了较高的抗氧化活性。此外，紫色胡萝卜富含多糖等物质，值得进一步的深入研究和开发利用。

[1]RANDI S,GJERMUND V,ELISABETH O,et al.Influence of field attack by carrot psyllid(Trioza apicalisForster)on sensory quality,antioxidant capacity and content of terpenes,falcarindiol and 6-methoxymellein of carrots(Daucus carotaL.)[J].J Agr Food Chem,2005,53(16):2831-2838.

[2]ANNE C K,BEVERLY A C,STEVEN J B,et al.Plasma and urine responses are lower for acylated vs nonacylated anthocyanins from raw and cooked purple carrots[J].J Agr Food Chem,2005,53(16):6537-6542.

[3]KATSUBE N,IWASHITA K,TSUSHIDA T,et al.Induction of apoptosis in cancer cells by bilberry(Vaccinium myrtillus)and the anthocyanins[J].J Agr Food Chem,2003,51(16):68-75.

[4]GHISELLI A,NARDINI M,BALDI A,et al.Antioxidant activity of different phenolic fractions separated from an Italian red wine[J].J Agr Food Chem,1998,46(2):361-367.

[5]张 镜，刁树平.海南蒲桃果实原花青素的体外抗氧化活性[J].食品科学，2012，33（17）：101-105.

[6]GELVAN D,SALTMAN P,POWELL S R.Cardiac reperfusion damage prevented by a nitroxide free radical[J].P Natl Acad Sci USA,1991,88(11):4680-4684.

[7]张启贵，魏梓芳，杨婷婷，等.不同品种甘薯汁抗氧化活性的研究[J].食品工业科技，2012，33（22）：119-122.

[8]陈健初，夏其乐，潘向荣，等.杨梅果汁的抗氧化特性研究[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2004，30（6）：657-661.

[9]谢晓凤，童莲花，童德胜，等.马齿苋总黄酮的提取及其浓缩汁抗氧化性研究[J].食品科技，2013，38（2）：192-197.

[10]王长祥，毕海燕.萝卜对亚硝酸盐清除作用的研究[J].中国卫生检验杂志，2009，19（2）：443-446.

[11]阚国仕，张瑞雪，陈红漫.胡萝卜多糖硫酸酯化修饰及其抗氧化活性研究[J].食品科技，2012，37（11）：170-173.

[12]李东华，叶春苗.萝卜籽中活性成分提取及抑菌效果的研究[J].沈阳化工大学学报，2013，27（1）：25-29.

[13]张春梅，陈朝银，赵声兰，等.核桃内种皮多酚提取工艺及体外抗氧化活性的初步研究[J].中国酿造，2014，33（7）：130-134.

[14]唐 琳，李子江，赵 磊，等.两种pH 值法测定玫瑰花花色苷含量的比较[J].食品科学，2009，30（18）：310-312.

[15]赵声兰，陈进伟，刘 芳，等.猪牙皂多糖提取工艺及体外抗氧化活性的研究[J].云南中医学院学报，2010，33（4）：15-18.

[16]赵 鹏，任 鹏，张月萍.原花青素抗氧化活性测定方法比较[J].现代化工，2012，32（5）：119-122.