超声波协同酶法提取芹菜中总黄酮的工艺优化

张翔宇，谭兴和，蔡 文，卢 卡，张 喻,*

（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

芹菜（celery）属伞形花科1年生或2年生草本植物，是一种丰富的可再生植物资源[1]。芹菜开始在我国被作为药用植物栽培，种植面积广泛[2]。芹菜具有降血压和血糖、抗动脉硬化、抗病毒、抗氧化以及增强免疫力等生物活性和药用价值[3]。研究表明[4]，其诸多的生理功效中，大多数都与黄酮有关[4-6]。黄酮（flavonoids）是一种天然植物成分，泛指两个苯环（A环与B环）通过三碳链相互联接而成的一系列（C6-C3-C6）化合物[7]。芹菜叶中的黄酮大多数以糖苷形式存在，其中最主要的是芹菜素[8]。经研究发现，芹菜黄酮与竹叶黄酮一样具有较高的生物活性，包括抗氧化活性以及清除自由基[9]的作用。总之，芹菜黄酮种类丰富，提取简单方便，生物活性高[10-11]，具有较高的研究价值和开发潜力。

为了能够更容易的提取芹菜中总黄酮，试验采用纤维素酶酶解法协同超声法来进行提取。多种方法的有效结合，可以优势互补，在温和可控的条件下提取更多的黄酮类化合物。在单因素试验的基础上，利用正交试验设计原理，优化工艺条件，为芹菜中总黄酮的深入研究做准备，并为其工业化生产提供一定的理论参考和实践经验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芹菜：购于湖南农业大学滨湖市场，于鼓风干燥箱中用40 ℃温度干燥后，粉碎过80目筛，备用；纤维素酶（酶活力360 U/g）：上海如吉生物科技发展有限公司；芦丁标准品：中国食品药品检定研究院；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

WFJ7200分光光度计：北京莱伯泰科有限公司；KQ5200DE超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SHZ-82水浴恒温振荡器：上海浦东物理光学仪器厂；ZN-400A高速中药粉碎机：长沙市岳麓区中南制药机械厂；TDZ5台式低速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芹菜中总黄酮提取工艺流程

芹菜→切碎烘干→粉碎→过60目筛→溶解（体积分数为70%的乙醇）→调节pH值→进行超声处理→酶解（加入纤维素酶）→水浴提取（50 ℃）→灭酶（80 ℃、5 min）→离心分离（5 000 r/min）→旋转蒸发除去乙醇→总黄酮粗提物

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

参照文献芦丁标准曲线测定方法[12-13]，设计试验如下：精密称取于120 ℃减压干燥至恒质量的芦丁标准品20 mg于100 mL容量瓶中，加入体积分数为60%的乙醇置于水浴中加热溶解，冷却后用体积分数为60%的乙醇定容，摇匀，即得到0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液。准确吸取该芦丁标准品溶液0、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL分别置于25 mL容量瓶中，分别加体积分数为30%的乙醇溶液至5 mL，加5% NaNO2溶液0.75 mL，摇匀，放置6 min，再加10% Al（NO3）3溶液0.75 mL，摇匀，放置6 min，加4%NaOH溶液10 mL，用蒸馏水定容，摇匀，放置15 min。以试剂空白作为参比，在最大吸收波长510 nm处测定吸光度值。

1.3.3 芹菜中总黄酮提取量的测定及得率的计算

准确吸取l mL总黄酮提取液置于25 mL容量瓶中，加入体积分数为30%的乙醇4 mL，然后按照1.3.2的方法操作。以空白试剂为参比，在最大吸收波长510 nm处测定吸光度值，由芦丁标准曲线方程计算提取液中总黄酮的质量浓度，再按如下公式计算芹菜中总黄酮得率[14]：

式中：C为提取液黄酮类物质的质量浓度，mg/mL；V为提取液的总体积，mL；M为芹菜干基质量，g。

1.3.4 单因素试验

在超声功率200 W、超声时间15 min、料液比1∶25（g∶mL）、加酶量150 U/g、pH 4.0的基础上，相应变换各因素的水平：超声功率选择100 W、150 W、200 W、250 W、300 W；超声时间选择10 min、20 min、30 min、40 min、50 min；料液比选择1∶10（g∶mL）、1∶15（g∶mL）、1∶20（g∶mL）、1∶25（g∶mL）、1∶30（g∶mL）；加酶量选择150 U/g、180 U/g、210 U/g、240 U/g、270 U/g；pH选择3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。按照1.3.2的方法提取芹菜中总黄酮，考察各因素对芹菜总黄酮的得率影响。

1.3.5 提取工艺优化正交试验设计

表1 提取工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization

以总黄酮得率为评价指标，分别考察酶解pH值、加酶量、超声功率、料液比和超声时间5个因素的影响，在此基础上，进行L16（45）正交试验，确定超声波-纤维素酶协同方法醇提芹菜中总黄酮的最佳工艺条件，正交试验因素水平见表1。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线回归方程的建立

以吸光度值（y）为纵坐标，芦丁标准品溶液质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，如图1所示。芦丁标准曲线方程：y=12.243x-0.010 5，相关系数R2=0.997 3，线性范围为0～20 μg/mL，结果表明，芦丁质量浓度与吸光度值具有良好的线性关系。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 酶解pH值对芹菜中总黄酮得率的影响

在加酶量为210 U/g，超声功率200 W，料液比为1∶25（g∶mL），超声时间40 min条件下，考察pH值对芹菜中总黄酮得率的影响，结果见图2。

图2 pH对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of pH on total flavonoids yield

由图2可知，在pH值为5.0时，芹菜中总黄酮的得率最大。每种酶在最佳作用pH值区间里，能够发挥纤维素酶的最大活力，使之最大限度破坏细胞壁，减小传质阻力，加速芹菜中黄酮类化合物的溶出效率；当pH值＜5.0或＞5.0时，化学环境使酶活力下降，总黄酮得率下降趋势明显。因此，选择pH值为5.0为宜。

2.3 加酶量对芹菜中总黄酮得率的影响

在pH值为5.0，超声功率200 W，料液比为1∶25（g∶mL），超声时间40 min条件下，考察加酶量对芹菜中总黄酮得率的影响，结果见图3。

图3 加酶量对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of enzyme addition on total flavonoids yield

由图3可知，随着纤维素酶用量的增加，总黄酮得率不断上升。当加酶量达到210 U/g时，总黄酮得率基本已达到最大值。纤维素酶在酸性介质中催化芹菜中的纤维素等多糖水解，导致细胞壁部分破损，细胞膜通透性增加，减少了黄酮向主体溶剂中扩散的阻力，从而加速黄酮的释放[15]。由图3可知，加酶量＞210 U/g以后，溶液中酶与底物浓度达到饱和状态，总黄酮得率变化不大。因此选择210 U/g作为加酶量最佳添加量。

2.4 超声功率对芹菜中总黄酮得率的影响

在pH值为5.0，加酶量为210 U/g，料液比为1∶25（g∶mL），超声时间40 min条件下，考察超声功率对芹菜中总黄酮得率的影响，结果见图4。

图4 超声功率对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield

由图4可知，芹菜中总黄酮的得率随着超声功率的上升而提高。超声波机械和空化作用使芹菜细胞壁破碎，促进细胞内的黄酮向溶剂中扩散，而且超声波还有热作用，更进一步促进其成分扩散，使黄酮类化合物更容易溶解到溶剂中，提高得率。因此选择200 W作为最佳的超声功率。

2.5 料液比对芹菜中总黄酮得率的影响

在pH值为5.0，加酶量为210 U/g，超声功率200 W，超声时间40 min条件下，考察料液比对芹菜中总黄酮得率的影响，结果见图5。

图5 料液比对总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids yield

由图5可知，料液比在1∶10～1∶30（g∶mL）范围内总黄酮得率变化趋势是先增大后减少，当料液比达到1∶25（g∶mL）时，总黄酮得率增加至最大，之后开始下降，这是因为溶剂量越高，乙醇与芹菜粉末之间的接触面积变大，从而有利于促进黄酮成分的溶出。因此选择最适料液比为1∶25（g∶mL）。

2.6 超声时间对芹菜中总黄酮得率的影响

在pH值为5.0，加酶量为210 U/g，超声功率200 W，料液比为1∶25（g∶mL）条件下，考察超声时间对芹菜中总黄酮得率的影响，结果见图6。

图6 超声时间对总黄酮得率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic time on total flavonoids yield

由图6可知，在10～40 min范围之内，芹菜中总黄酮的得率随超声时间的增加而增大，并于40 min时达到最大，之后开始下降。这是因为适当延长超声时间，对原料组织的破碎程度增强，可使溶质在溶剂中充分扩散，从而增加总黄酮得率。但长时间的高温和超声波共同作用则破坏了部分提取物，导致检测到的总黄酮减少。所以超声时间选择为40 min最佳。

2.7 提取工艺优化正交试验

以芹菜中总黄酮得率为评价指标，根据单因素试验结果，选择酶解pH值、加酶量、超声功率、料液比、超声时间5个因素作为考察因素，分别选取4个水平进行L16（45）正交试验，结果见表2，方差分析见表3。

表2 提取工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，各试验因素对芹菜中总黄酮得率影响大小顺序为加酶量＞超声时间＞超声功率＞pH值＞料液比。采用超声波-纤维素酶协同方法醇提芹菜中总黄酮的最优组合为A2B3C4D3E4，即酶解pH值为4.0、加酶量210 U/g、超声功率200 W、料液比1∶25（g∶mL）、超声时间40 min。在此条件下进行验证试验，总黄酮得率为1.018 4%。

由表3可知，加酶量、超声功率、超声时间对试验结果的影响极显著，pH值对结果的影响显著。料液比对结果的影响不显著。

3 结论

单因素试验结果数据表明，酶解pH值、加酶量、超声功率、料液比、超声时间对芹菜中总黄酮的得率均有不同程度的影响。正交试验结果数据表明影响芹菜中黄酮提取的5个因素的主次关系为：加酶量＞超声时间＞超声功率＞酶解pH值＞料液比；采用超声波-纤维素酶协同方法醇提芹菜中总黄酮的最优工艺条件为酶解pH 值为4.0、加酶量210 U/g、超声功率200 W、料液比1∶25（g∶mL）、超声时间40 min。在此条件下，芹菜中总黄酮的得率可达到1.018 4%。

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