碱蓬内生真菌JP3的分离、鉴定及促生作用研究

赵 颖, 于 飞, 郭明敏, 卜 宁

(沈阳师范大学 化学与生命科学学院, 沈阳 110034)



碱蓬内生真菌JP3的分离、鉴定及促生作用研究

赵 颖, 于 飞, 郭明敏, 卜 宁

(沈阳师范大学 化学与生命科学学院, 沈阳 110034)

为研究盐生碱蓬(Suaedaglauca)植物体内生菌及其产生的生物学活性物质对植物的促生长作用,利用组织分离法对碱蓬内生菌进行分离;用水培法测定碱蓬内生真菌对水稻幼苗株高、干重、叶绿素含量等生理指标的影响;对具有明显促生活性的菌株根据形态、培养特征和18SrDNA测序分析进行分类鉴定。从健康碱蓬植株的根、茎、叶中分别分离出19株、70株和49株,共138株内生菌,其中细菌13株、真菌122株、放线菌3株;筛选出对水稻幼苗具明显促生活性的真菌JP3,由该菌处理的水稻幼苗与对照相比其干重增加12.23%,株高增加15.6%(P<0.05),总叶绿素含量增加了13.2%;18SrDNA测序和比对结果显示JP3属Glomerellacingulata,相似性大于97%。研究表明:碱蓬植物内生菌具有丰富、多样的特点,是产生促生物学活性物质的重要微生物资源,可为开发新的植物促生剂提供生物源物质。

碱蓬内生真菌; 分离; 鉴定; 促生作用

0 引 言

植物内生菌是一类重要的微生物资源,有关植物内生菌与植物间的互作影响及其机制的研究已越来越引起人们的关注[1-2]。有研究表明,感染内生菌的植株比未感染的植株往往具有生长速度更快、对逆境的抵抗能力更强、对病虫害的抵抗力强,具有更强的生存竞争力[3]。微生物肥料具有肥效高、本身无毒、不污染环境且成本低等特点,是比较理想的替代品,因此,合理开发和利用微生物肥料,尤其是开发内生菌资源,是提高作物的产量和促进农业持续发展的重要途径[4]。

土壤盐碱化使植物叶绿素含量、净光合速率以及水分利用效率等逐渐降低,是制约我国农作物产量的主要因素之一[5]。碱蓬(Suaeda salsa)是一种生长于盐碱地和海滨沙滩的耐盐性极强的盐生植物,在我国分布广泛,是当前生物改良盐渍土的首选植物品种[6]。长期以来,由于受盐渍化土壤是“生命禁区”思想的禁锢,对盐渍化极端生态下的微生物尤其是处于该环境下的植物内生菌研究、开发与利用很少有人问津。本研究从辽宁省盘锦市红海滩自然保护区的碱蓬植株中分离获得了内生菌,并对其中的促生活性菌株进行了筛选鉴定,旨在为进一步研究及开发碱蓬内生菌资源提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物 盐生碱蓬(Suaeda glauca bge),于10月份采于辽宁省盘锦市红海滩湿地自然保护区。

1.1.2 供试水稻(Oryza sativa L.) 辽星1号,由沈阳农业大学水稻研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 碱蓬内生真菌的分离纯化

采用组织块法[7]对碱蓬内生真菌进行分离。 取新鲜、无虫害的健康碱蓬组织用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分, 切掉须根,切取主根、茎成1.0 cm长的小段, 叶保留完整,进行表面消毒处理[8]: 用无菌水冲洗3～4遍, 75%酒精浸泡1 min, 无菌水冲洗3～4次, 在用0.1%升汞浸泡5 min, 无菌水冲洗4～5次。 样品用无菌吸水纸吸干后备用。 将待分离的组织用无菌手术刀切成0.5～1.0 cm大小, 置PDA平板上, 25 ℃培养箱中培养, 根据菌落形态挑取不同真菌然后进行纯化并接种于PDA斜面培养基上, 4 ℃保存备用。 吸取50 μL最后一次洗涤水涂布在PDA平板上, 至于25 ℃培养箱中培养, 作为空白对照。

1.2.2 筛选

1.2.2.1 碱蓬内生菌对水稻幼苗生长的影响

实验材料选取子粒饱满整齐的水稻种子,于28 ℃恒温箱浸种24 h后,于30 ℃时催芽24 h。取发芽的水稻种子,整齐的摆放在含纱网的塑料烧杯上,烧杯内装满Hoagland 营养液进行水培。于人工气候箱(昼夜温度28 ℃/26℃;光照16 h;80%相对湿度;光强3 000 lux)中培养4 d,生长过程中每天定时定量补充营养液。4 d后用培养9 d的内生真菌及发酵液30 mL处理水稻幼苗,各处理重复3次,对照则加30 mL的培养液。继续培养5 d后从每盆随机抽取幼苗10株,洗净根系,用直尺测量其株高。80 ℃烘干至恒重,精确称量水稻的干重,详细记录数值。

1.2.2.2 碱蓬内生菌对水稻幼苗叶绿素含量的影响

用丙酮乙醇混合液法提取叶绿素,将丙酮乙醇按1∶1比例配成混合浸提液,备用。称取0.1 g叶片,切碎置于离心管中,加入5 mL混合液,置于暗处,于室温条件下浸提24 h。用混合浸提液作空白调零,测645、670、663 nm处的吸光度。

1.2.3 碱蓬内生真菌JP3的鉴定

筛选出的的优势菌种进行形态学及分子生物学鉴定。使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA作为PCR模版。以18S-ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和18S-ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′为引物进行扩增。将测得的18SrDNA序列在GenBank中进行BLAST分析,构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 碱蓬内生菌分离纯化

图1 碱蓬组织块(根)中分离的植物内生真菌

采用组织块分离法从健康碱蓬植物的根、茎、叶中共分离到138株内生菌(图1), 其中细菌13株、真菌122株、放线菌3株; 根、茎、叶中分别分离得到内生菌19株, 70株, 49株, 分别占内生菌总数的13.8%、50.7%和35.5%。 由此可知, 碱蓬组织中内生菌的分布有所差异, 茎中内生菌数量最多; 内生真菌在数量上占有较大的优势, 内生细菌和内生放线菌相对较少。

2.2 促生活性内生真菌的筛选

2.2.1 碱蓬内生菌对水稻幼苗生长的影响

菌株及发酵液对水稻幼苗的促生作用见图2,从122株内生真菌中筛选出3株对水稻幼苗的长势有明显促进作用的内生真菌:JP3、JP4和JP2。三株菌处理水稻幼苗后,水稻的高度明显大于对照组CK。水稻幼苗在培养10 d后,测定各实验组和对照组水稻幼苗的株高和干重(结果见表1)。由表1可知, JP3和JP4菌株发酵液处理的水稻幼苗干重与对照的差异显著,提高幅度分别为12.23%及8.93%,而JP2菌株发酵液处理的水稻干重差异不显著,提高幅度为7.84%;3种内生真菌处理的水稻株高与对照的差异显著,提高幅度分别15.6%、14.2%和12.8%。

图2 菌株及发酵液对水稻幼苗的促生作用

表1 3株碱蓬内生菌对水稻幼苗生长的影响

实验组别株高/cm干重/gCK16．71±0．65c0．098±0．004bJP319．32±1．33b0．110±0．002aJP420．87±0．74a0．107±0．005aJP218．98±1．09b0．105±0．06ab

注:表中数值表示平均值±标准偏差,不同的字母代表不同的显著性差异(Duncan-test,P<0.05)。

图3 对水稻幼苗叶片叶绿素含量的影响(Duncan-test,P<0.05)

2.2.2 碱蓬内生菌对水稻幼苗叶片叶绿素含量的影响

由图3可以看出, JP3、JP4和JP2处理的水稻叶片叶绿素a、叶绿素b含量及二者总含量(以鲜质量计)均有升高,叶绿素b及总叶绿素含量与不加菌处理的对照差异显著,提高幅度分别为 23.1%、27.6%和24.3%;13.2%、16.8%和14.5%,而叶绿素a差异不显著,提高幅度分别为10.7%、12.9%和12.1%。发酵液处理后,叶绿素b的变化幅度及差异性明显高于叶绿素 a,说明碱蓬内生菌对叶绿素a和b的影响有差异。

2.3 碱蓬内生真菌JP3的鉴定结果

形态学鉴定:内生菌的培养形态及显微观察结果如图4所示。JP3在PDA培养基上平均生长速度约为6 mm·d-1。菌落初呈白色,后中心粉红,外层为白色,菌落表面有黑色辐射状沟纹,有红色色素产生。菌落致密,基质反面黑红色,菌落表面有透明液体状渗出物,菌丝表面光滑。在光学显微镜下菌丝无色,分枝,有横隔,自发地形成以特殊的菌丝变态形成的捕食器官收缩环。

(a)—Y11的菌落; (b)—Y11的菌丝形态(100×); (c)、(d)—Y 11的菌丝形态(400×)。

JP3菌株18SrDNA序列扩增和序列分析比对结果见表2, NCBI数据库中与菌株JP3相似度较高的菌株均属Glomerella sp.其中模式种Glomerella cingulata与菌株JP3的相似性达到了99%(图5)。

表2 具促生活性的碱蓬内生真菌的18SrDNA比对结果

图5 基于18SrDNA序列的JP3菌株的系统发育树

3 讨 论

目前,关于盐地碱蓬植物内生菌的相关研究的报道很少。辽宁盘锦红海滩碱蓬长期生长在高盐的特殊环境中。本研究对盐生碱蓬的内生菌进行了分离和鉴定,结果表明,尽管碱蓬体内盐浓度很高,在一定程度上限制了内生菌的数量及种类,但在其体内仍然存在丰富的内生菌资源,本次研究先后共分离得到138株碱蓬内生菌,其中以茎中最多,其次为叶,而根中最少。这一特点与钮旭光等[9]分离的碱蓬内生菌的数量分布为根内最多,其次是茎和叶片的分布规律不同,可能是由于不同地区、不同品种、不同分离时期所分离的内生菌数量不同。

碱蓬体内高盐环境中的微生物与植物长期共同进化的过程中可能形成某些代谢机制或者产生某些代谢产物使植物能够适应盐碱的极端环境, 促进宿主生长, 现有的文献在这方面已有报道, 涉及农作物、蔬菜及水果等各个领域[10-15]。 本试验结果表明, 从碱蓬中分离得到的JP3菌株对水稻幼苗的生长有明显的促进作用, 菌株发酵液处理组比对照组的水稻幼苗健壮、叶色浓绿、植株高、干物质的积累增加。

本研究对所分离得到的碱蓬内生菌进行了分离鉴定, 结果表明盐生碱蓬体内存在丰富的内生菌资源, 但在筛选功能促生活性菌株所采用的方法比较繁杂,工作量大, 在研究中应找到更为有效和简便的方法来对碱蓬内生菌资源进行挖掘和深入研究, 例如采用ACC为唯一的氮源快速筛选具有ACC脱氨酶活性的菌株[16]研究这类菌株的促生活性, 这将为内生菌对植物的促生机制方面提供新的思路。

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Isolation, identification and growth-promoting effect ofSuaedasalsaendophyte fungus JP3

ZHAOYing,YUFei,GUOMingmin,BUNing

(College of Chemistry and Life Science,Shenyang Normal University, Shenyang 110034,China)

Endophytes were isolated fromSuaedasalsaby tissue isolation to study the effects on promoting plant growth.Hydroponic experiments were carried out to study the role of endophyte fungi on rice seedling growth.Rice shoot height, dry weight and chlorophyll (Chl) content were determined.Strains were identificated according to endophytes morphology, characteristic and 18S rDNA sequencing results.138 endophytes were isolated from the roots (19 endophytes), stems (70 endophytes) and leaves (49 endophytes) ofSuaedaglauca, respectively, including 13 endophyte bacteria, 122 endophyte fungi and 3 endophyte actinomyces.Endophyte fungus JP3 which promoting rice seedling growth was screened.Shoot length, dry weight and chlorophyll (Chl) content of rice treated with endophyte fungus JP3 were significantly increased by 15.6%, 12.23% and 13.2%, respectively of the control.Endophyte fungus JP3 belonged toGlomerellacingulatafamily and had 97% similarity to otherGlomerellaspstrains according to 18S rDNA sequencing results.The results showed that endophytes isolated fromSuaedaglaucahad the traits of rich and diversity, which were the important microorganism resources and supplied biological source substances to exploit new plant growth promoting agent.

Suaedasalsaendophyte fungi; isolation; identification; promoting growth effect

2014-08-17。

国家自然科学基金资助项目(31270369); 沈阳师范大学实验中心主任基金资助项目(SY201102)。

赵 颖(1989-),女,辽宁沈阳人,沈阳师范大学硕士研究生; 卜 宁(1960-),女,河北昌黎人,沈阳师范大学教授,硕士研究生导师。

1673-5862(2015)01-0116-05

Q949.714.2; Q949.32

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2015.01.026