川西獐牙菜活性成分对NO-2的清除作用研究

罗翠婷 江富祥 陈河如1.广东省湛江中医学校，广东 湛江 54094；.暨南大学药学院中药及天然药物研究所,广东 广州 51063

川西獐牙菜活性成分对NO-2的清除作用研究

罗翠婷1,2江富祥2陈河如2
1.广东省湛江中医学校，广东 湛江 524094；2.暨南大学药学院中药及天然药物研究所,广东 广州 510632

目的：分析川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch)的活性化学成分对亚硝基(NO2-)的清除作用，为寻找川西獐牙菜的防癌活性成分提供科学依据。方法：使用紫外分光光度法测定亚硝基的含量，根据活性追踪的结果筛选出对NO2-有较好的清除作用的口山酮类化合物。结果：川西獐牙菜乙醇提取物的正丁醇萃取部位对NO2-的清除率最高，并筛分出清除能力最好的化合物是7-羟基-3,4,8-三甲氧基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖-口山酮苷。结论：川西獐牙菜清除NO2-的活性物质是一些极性较大的化合物，为进一步研究川西獐牙菜的防癌作用及相关产品的开发奠定了实验基础。

川西獐牙菜；NO2-；口山酮；防癌作用

随着工业化进程的不断加快，环境恶化日益严重，使人们的生活压力不断增加，癌症患者的数量也迅速攀升。虽然癌症的发病原因是多方面的，但环境污染产生的化学致癌物质是导致癌症频发的重要原因之一。N-亚硝基化合物是目前所知的最强的化学致癌物质之一，例如N-亚硝胺(nitrosodimethylamin，简称NDMA)能致人和动物多种器官发生癌变[1]。正常情况下，人们从食物中直接摄入的亚硝胺的量是非常微量的，但NO2-在体内与胺类或酰胺类化合物相遇后可直接进行亚硝化反应，生成的亚硝胺具有强致癌性，且亚硝胺生成速度与NO2-浓度的平方成正比，严重危害人体健康。因此，阻断NDMA合成或清除亚硝胺的前体——亚硝酸根是预防癌症的有效途径[2]。

川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch)为龙胆科(Geniianaceac)獐牙菜属(Swertia)植物[3-4]，是我国青藏高原特有植物，俗称“藏茵陈”。川西獐牙菜对肝胆实热性疾病具有独特的疗效[5-6]，临床上常用来治疗急慢性肝炎、胆囊炎等，疗效非常显著[7]。研究发现川西獐牙菜不仅具有抗炎作用，而且对NO2-也有良好的清除效果，从而产生抗瘤防癌的作用，这可能与它们所含的口山酮、还原性糖类、生育酚等活性物质有关。这些还原性物质可使NO2-还原为NO，从而降低体内NO2-含量，抑制亚硝化反应发生的可能[8]。

本研究运用活性追踪的方法，通过多种分离手段得到活性单体化合物，并采用紫外分光光度法筛选出对亚硝酸根有良好清除效果的化合物，旨在寻找具有抗癌防癌活性较好的川西獐牙菜活性成分。

1 仪器与材料

1.1 仪器 BRUKER AV-300和AV-400型核磁共振仪(瑞士Bruker公司)； Finnigan LCQ Advantage MAX质谱仪(美国菲尼根公司)； Agllent1200型高效液相色谱仪Chemstion工作站(美国Agilent公司)； TU-1810S型号紫外分光光度计(日本岛津)；HH-S数显恒温水浴锅(江苏金坛市金城国胜试验仪器厂)。

1.2 实验材料 薄层层析硅胶高效薄层预制板、柱层析硅胶(100-200目、200- 300目，烟台化学工业研究所)；Sephadex LH-20(25-100μm)柱层析填料(GE Healthcare公司)；色谱纯甲醇(山东禹王化工公司)；乙睛为色谱纯(迪马公司)；对氨基苯磺酸、N-1萘乙二胺盐酸盐、亚硝酸钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、盐酸均为分析纯；水为蒸馏水(屈臣氏)。川西獐牙菜药材由中科院西北高原微生物研究所提供，由青海西宁孙菁副研究员鉴定为龙胆科獐牙菜属SwertiamussotiiFranch，样品保存于中科院西北高原微生物研究所。

2 方法

2.1 提取与分离 取2.5 kg川西獐牙菜药材，将其研磨成粉末，用75%乙醇热回流提取3次，过滤，将提取液合并，回收乙醇，然后在60℃真空箱干燥，得干浸膏509.7g。将浸膏研碎，溶于水中，以等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇多次萃取，得到5个萃取部位，即石油醚部位35g、二氯甲烷部位92g、乙酸乙酯部位42.2g、正丁醇部位170g以及水部位170.5g。根据活性筛选结果，采用硅胶、Sephadex LH-20、C18以及反相HPLC等多种色谱技术，对活性部位进行分离纯化。

2.2 川西獐牙菜对NO2-的清除实验

2.2.1 溶液的配制 ①0.4%对氨基苯磺酸溶液的配制：称取0.4 g对氨基苯磺酸溶于100 ml 20%盐酸中，混合均匀，避光保存。②0.2% N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液的配制：称取0.2 g盐酸萘乙二胺溶于100 ml蒸馏水中，混合均匀，避光保存。③亚硝酸钠标准溶液的配制：亚硝酸钠预先置于硅胶干燥器中干燥24 h，准确称取0.100g，加水溶解，定容至250 ml(浓度为400μg/ml)，作为储备液。取储备液1.25 ml稀释至100 ml(浓度为5 μg/ml)，待用。

2.2.2 实验方法 原NO2-溶液的吸光度测定[1-7]：取5μg /ml的NaNO2标准溶液3 ml，用磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液分别调节pH=3和pH=7，室温下反应20 min后，立即加入2 ml 0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后，加入1 ml 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，以5ml蒸馏水为空白对照，在544nm处测吸光度A2。

加入待测样品后NO2-溶液的吸光度测定：取3mg/ml的川西獐牙菜样品(先是川西獐牙菜的各个萃取部位，然后是正丁醇部位各流分，再是筛选后流分的单体化合物)1ml于25 ml容量瓶，加入5μg /ml的NaNO2标准溶液3ml，室温下反应30min后，用磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液分别调节pH =3和pH=7，立即加入2ml 0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后，加入1ml 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，以5ml蒸馏水为空白对照，在544 nm处测吸光度A1。

亚硝酸根的清除率(%)=[(A2- A1)/A2] ×100

式中A2是原NO2-溶液的吸光度，A1是加入待测样品后NO2-溶液的吸光度。

3 结果与讨论

3.1 各萃取部位对NO2-的清除率 测试样品为萃取的4个部位，在pH=3条件下按上面步骤操作，结果见表1。

从表1中可知，正丁醇萃取部位的亚硝酸根清除率最大，而且活性比川西獐牙菜醇提的浸膏还要好，因此可进一步对正丁醇的萃取部位进行分离纯化，旨在筛选出具有清除亚硝酸根活性好的化合物。

3.2 正丁醇部位粗分流分对NO2-的清除率 测试样品为正丁醇部位粗分流分，在PH=3条件下按上面的步骤操作，结果见于表2。

表1 5个萃取部位的亚硝酸根清除率

表2 正丁醇部位粗分流分的亚硝酸根清除率

从表2可知，P-1到P-9各流分清除能力都不错，可对这9个流分进一步分离纯化，寻找具有亚硝酸根清除率高的单体化合物。

3.3 正丁醇部位的分离与结构鉴定 根据活性筛选的结果，取正丁醇P-1～P-9活性萃取部位，综合运用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱，以及反相HPLC等多种现代色谱分离手段，对川西獐牙菜正丁醇活性部位进行了分离纯化，通过化合物的理化性质和现代波谱学手段(UV、IR、MS、HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR)鉴定了13个化合物的结构。其中化合物1、化合物2、化合物3是新化合物，而化合物6、化合物8、化合物9、化合物10、化合物12为首次从该植物中分离得到。以下为化合物的结构：

L1 R1=-Oglu, R2=R4= -OCH3，R5=-OH, R3=R6=R7=H[10]L2 R1=-Oglu, R2=R3=R7= -OCH3，R6=-OH, R4=R5=H8L3 R1=-Oglu, R2=R3= R6=R7= -OCH3, R4=R5=H[10]L4 R1=R7=-OH,R2=-OCH3,R3=R4=R5=H,R6=-O-[rha-(1→2)-glu][11]L5 R1=R7=-OH,R2=-OCH3,R3=R4=R5=H,R6=-O-[rha-(1→3)-xyl-(2→1)-rha]L6 R1=-Oglu,R2=R6=R7=-OCH3,R3=R4=R5=H[12]L7 R1=R7=-OH,R2=-OCH3,R3=R4=R5=H,R6=-O-[rha-(1→2)-xyl][13]L8 R1=R7=-OH,R2=R3=-OCH3，R6=-Oglu,R4=R5=H[13]L9 R1=R7=-OH,R2=-OCH3，R6=-Oglu,R3=R4=R5=H[14]L10 R1=-OH,R2=R3=-OCH3，R6=-Oglu,R4=R5=R7=H[15]L11 R1=R2=R4=-OH,R3=R5=R6=H，R7=-Oglu[12]L12 R1=-Oglu,R2=R6=R7=-OH,R3=R4=R5=H[16]

L13 芒果苷[16]

3.4 正丁醇部位单体化合物对NO2-的清除率 由表3可知，正丁醇部位前九个流分分离纯化得到的单体化合物都有亚硝酸根清除能力，其中新化合物L2活性最好，清除率达86.02%。另外，这些化合物在pH=3的条件比pH=7的条件下清除亚硝酸的能力要好，这对研究它在人体条件下pH对其清除率的影响提供一定的依据。

表3 正丁醇部位单体化合物的亚硝酸根清除率(%)

4 结论

本研究采用紫外分光光度法模拟在人体胃液条件下分析川西獐牙菜的活性成分对NO2-的清除作用，发现川西獐牙菜醇提物的正丁醇萃取部位对NO2-的清除率最高，并且对它的粗分流分进行活性追踪，研究发现川西獐牙菜清除NO2-的活性物质是极性较大的物质，其中新化合物7-羟基-3, 4, 8-三甲氧基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖-口山酮苷化合物清除能力最好，为寻找防癌抗癌成分提供科学依据。

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Scavenging Effect of active chemical constituents FromSwertiamussotiion NO2-

LUO Cui-ting1JIANG Fu-xiang2CHEN He-ru2

1.Zhanjiang Chinese Medicine School, Zhanjiang 524094, China；
2.Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Product, College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China

Objective To analyze the scavenging effect of active chemica constituents fromSwertiamussotiion NO2-, To provide a scientific basis for searching the anti-cancer active components fromSwertiamussotii. Method the UV spectrophotometry was used to determine the NO2-content, screening out xanthone compounds with the effect to scavenge NO2-according to the active tracking results. Results The n-butanol fraction of the ethanol extracted ofSwertiamussotiishowed a highestscavenging rate,and 7-hydroxy-3,4,8-trimethoxy-1-O-β-D-glucopyranosyl-xanthone is the best compounds from the Screening experiment. Conclusion The active substances with the effect to scavenge NO2-is high polar compounds inSwertiamussotii．This result should lay a theoretical foundation for the further research on the cancer prevention ofSwertiamussotiiand development of the relevant products．

Swertiamussotii；NO2-；xanthone；cancer Prevention

R284.2,R285.2

A

1007-8517(2015)10-0022-03

2015.02.28)