龙陵县不同时期栽培铁皮石斛多糖及生物碱含量比较分析

文美琼 李璐 杨申明 徐成东 段瑞才 许小陵云南楚雄师范学院化学与生命科学院，云南 楚雄 675000

龙陵县不同时期栽培铁皮石斛多糖及生物碱含量比较分析

文美琼 李璐 杨申明 徐成东*段瑞才 许小陵
云南楚雄师范学院化学与生命科学院，云南 楚雄 675000

目的：比较3年生铁皮石斛3月枝条的及8月枝条多糖及生物碱含量。方法：采用溶剂提取法提取多糖及生物碱，用分光光度法测定多糖及生物碱含量。结果：茎部各部位、不同时期的铁皮石斛多糖含量在15.66%～26.63%之间，生物碱含量在0.016%-0.021%之间。结论：多糖含量茎中部最高，其次是茎上部，茎下部含量最低；多糖含量随生长时间增长而增加，且在不同生长时期、不同部位，多糖含量差别较大。生物碱为茎上部含量最高，其次是茎中部，含量最低为茎下部；不同生长时期除茎下部外，生物碱含量随生长时间增长反而减小，但不同部位的铁皮石斛生物碱含量差别较小。

铁皮石斛；生物碱；多糖；含量；不同时期

铁皮石斛为兰科石斛属植物铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)的干燥茎，是我国传统的滋阴名贵中药，其保健功效日愈为人们所重视。

铁皮石斛具有养阴生津、止咳化痰、抗肿瘤和抗突变作用。现代药理研究发现，铁皮石斛具有降血糖、增强机体免疫力、抗氧化、抗疲劳、抗血栓、改善血液流变性、改善眼部球结膜的微循环，预防白内障等作用[1-2]。多糖是铁皮石斛的主要活性成分及特征性成分，其含量与药理作用有着密切关联，其水溶性多糖还是一类免疫增强剂，具有较强的抗肿瘤生物活性，可促进淋巴细胞产生淋巴因子，增强机体体液免疫功能、细胞免疫功能，增强机体自身免疫。生物碱也是石斛中重要的活性成分之一，药理作用主要表现在抗肿瘤、对心血管和胃肠道抑制作用及止痛退热等方面[3-4]。石斛碱和多糖的药理作用能基本反映石斛养阴清热、益胃生津的功效[5]。

龙陵县地处云南西南边陲，境内最低海拔535m，最高海拔3001m，气候类型复杂，降雨丰富，空气相对湿度84%。复杂多样的气候环境造就了复杂多样的生物类型，全县境内约有石斛属植物40余种[6]，石斛产业是该县一项特色产业。

本文通过对产自云南龙陵县株龄为3年的人工栽培铁皮石斛3个月枝条及8个月枝条茎部多糖及生物碱含量进行测定，揭示了在生长期相差较短时铁皮石斛多糖及总生物碱含量的变异规律，对铁皮石斛质量控制、优质铁皮石斛培育及采收时间有重要的理论价值与现实意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-2100紫外可见分光光度计[龙尼柯(上海)仪器有限公司]；800型离心沉淀器(上海手术器械十厂)；红外快速恒温干燥箱(鄄城威瑞科技仪器有限公司)；CP 214C电子天平(奥豪斯仪器有限公司制造)；DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机(温岭市大机械有限公司)；HH-S电热恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂)；循环水真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；PHS-3C型酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

1.2 试剂 石油醚、丙酮、无水乙醇、5%苯酚溶液(称取苯酚100g，加铝粉0.1g和碳酸氢钠0.05g，常压蒸馏，收集182℃馏分，称取该馏分5g，加100ml蒸馏水混匀后，溶解置于棕色试剂瓶中制得)、浓硫酸、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、溴甲酚绿、氨水、三氯甲烷均为分析纯；水为试验室自制超纯水。

1.3 材料 D-无水葡萄糖对照品和石斛碱对照品(南京春秋生物工程有限公司)；铁皮石斛采自云南保山龙陵县株龄为3年的人工种植铁皮石斛3个月及8个月枝条，并由楚雄师范学院化学与生命科学院生物学教授徐成东鉴定为铁皮石斛。

2 方法与结果

2.1 多糖含量测定[7]

2.1.1 葡萄糖标准曲线绘制 将葡萄糖标准品配制成浓度为100μg/ml标准溶液。精密移取此溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00ml分别置于比色管中，加蒸馏水至2.00ml，各加5%苯酚溶液1.00ml，迅速滴加浓硫酸5.00ml，摇匀，放置5min;置于沸水浴中加热15min后取出，流水冷却1min，静置至室温;待40min后在490nm波长下测其吸光度。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程。得葡萄糖标准曲线线性回归方程为：A=0.01476c+0.01632，r=0.9996。说明葡萄糖浓度在0～50μg/ml范围内浓度c(μg/ml)与吸光度A具有良好的线性关系。

2.1.2 多糖的提取与精制 将不同时期铁皮石斛茎部不同部位洗净,自然晾干,60℃烘干，粉碎后密封保存备用。精密称取样品粗粉0.500g，用滤纸包好，先加入石油醚30ml回流脱脂1h，再用80%乙醇30ml回流1h，打开滤纸包，待乙醇挥干后加入蒸馏水30ml回流提取3次(1、1、0.5h);趁热抽滤，三次滤液合并，用0.1%活性炭脱色后，抽滤，滤液水浴浓缩，冷却后定容到50ml容量瓶中，制得提取液;精确吸取1.00ml提取液置于离心试管中，加入7ml无水乙醇，搅拌，离心(4000r/min)10min，弃去上层清液，沉淀用热水溶解，定容至10ml，制得样品液。

精密称取铁皮石斛粗粉6.000g，按上述方法进行多糖提取，得到的沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤，制得多糖精制品，60℃烘干1h后保存备用。

2.1.3 稳定性试验 取样品液0.40ml，加蒸馏水至2.00ml，按“标准曲线”项操作，在5～60min时间范围每隔5min测定吸光度。结果样品液在60min以内变化不大，说明样品在60min内稳定性较好。

2.1.4 精密度试验 精密移取样品液0.40ml各五份，分别加蒸馏水至2.00ml，按“标准曲线”项操作，待40min后在490nm波长下测其吸光度。精密度试验测定结果为RSD= 0.37%(n=5)，表示试验的精密度较好。

2.1.5 葡萄糖与多糖换算因素的测定 精确称取多糖精制品10mg，定容到100ml容量瓶中，摇匀。取此多糖溶液0.40ml，按“标准曲线”项操作，40min后测定吸光度。按下式计算换算因素F：

F=m/(C·D)

m多糖质量，C为多糖液中的葡萄糖浓度，D为多糖的稀释因素。测得多糖与葡萄糖换算因素F=2.23。

2.1.6 石斛多糖含量的测定(重复性试验)精密移取铁皮石斛3个月枝条茎部各个部位样品液各1.00ml，8个月枝条各部位样品液0.40ml置于比色管中，加蒸馏水至2.00ml，按“标准曲线”项操作，40min后在490nm波长下测其吸光度。

按下式计算样品中多糖的含量：

式中，Cs为样品液中葡萄糖浓度(μg/ml)，D为样品液的稀释因素，F为换算因素，V为样品液体积(ml)，ms为样品质量(μg)。

由表1可知， 3年生铁皮石斛枝条茎中部多糖含量最高，其次是茎上部，茎下部含量最低；在不同生长期时，茎部各部位多糖含量随生长时间增长而增加，8个月枝条茎中部多糖含量可高达26.63%，而3个月枝条茎中部的多糖含量仅达20.29%。

铁皮石斛多糖含量与种质资源、生长年限、环境及栽培条件有关。本文采集的3年生铁皮石斛其枝条从3个月到8个月这个期间可能生长明显减慢，合成的有机物主要积累在植株体内，因此多糖含量显著上升[8]。2.1.7 回收率试验 精确称取铁皮石斛8个月枝条茎中部粗粉0.500g各三份，分别加入多糖精制品108mg、135mg、162mg，用滤纸包好。按“多糖的提取”方法，制得三份试液。分别取0.40ml于比色管中，加蒸馏水至2.00ml，按“标准曲线”项操作，待40min后在490nm波长下测其吸光度。测得回收率为100.3%(RSD=0.12%，n=3)。

2.2 生物碱含量测定[7]

2.2.1 石斛碱标准曲线绘制 配制浓度为10μg/ml的石斛碱标准溶液。准确移取上述溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00ml置于分液漏斗中，分别加入三氯甲烷稀释至10.00ml后，依次加入5.00ml pH4.5的缓冲溶液、1.00ml0.04%的溴甲酚绿溶液，剧烈振摇3min后静置30min，用三氯甲烷浸泡并干燥后的药棉过滤三氯甲烷层，准确量取滤液6.00ml于比色管中，加1.00ml 0.01mol/L的氢氧化钠无水乙醇溶液，摇匀，放置25min。以10.00ml三氯甲烷同样操作作为空白对照，在620nm波长处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，石斛碱浓度c为横坐标绘制标准曲线。得到石斛碱标准曲线的线性回归方程为A=0.0016c+0.0006，r=0.9998。表明石斛碱浓度在0～60μg/ml范围内浓度c(μg/ml)与吸光度A具有良好的线性关系。

2.2.2 生物碱的提取 准确称取铁皮石斛各部位样品0.5000g，置于125ml磨口圆底烧瓶中，加入30ml石油醚于35℃恒温水浴中脱脂30min，弃出上清液，挥干石油醚，用少量氨水湿润，加塞放置30min，准确加入三氯甲烷10.00ml，称重，置于水浴锅中于80℃温度下恒温水浴回流提取2h，室温冷却20min后补充三氯甲烷至原重，再用三氯甲烷浸泡并干燥后的药棉过滤，滤液为样品液。

2.2.3 稳定性试验 分别吸取2.00ml样品液，按“标准曲线”项操作，在620nm波长处间隔，在5～60min时间范围每隔5min测定吸光度。结果表明样品液在15～40min后显色基本稳定，说明样品在40min内稳定性较好。所以本试验均放置25min后再进行吸光度的测定。

2.2.4 精密度试验 准确吸取样品液5份各2.00ml于5支分液漏斗中，按“标准曲线”项操作，在620nm波长处测定吸光度。精密度试验测定结果为RSD= 4%(n=5)。

2.2.5 总生物碱含量的测定(重复性试验) 分别称取铁皮石斛3个月及8个月枝条茎部各部位0.5000g各3份，按照“生物碱的提取”步骤操作制得样品液，准确吸取各样品液2.00ml于125ml梨形分液漏斗中，加8.00ml三氯甲烷稀释至10.00ml，按“标准曲线”项操作，在620nm波长处测定吸光度。

由表1可见，3年生铁皮石斛枝条茎上部生物碱含量最高，其次是茎中部，茎下部含量最低；在不同生长期时，生物碱含量随生长时间增加反而减小(茎下部除外)，但差别较小。2.2.6 回收率试验 称取样品3个月枝条茎上部0.500g 6份，分别加入石斛碱对照品溶液5.00ml3份、10.00ml3份，按照“生物碱的提取”步骤操作，制得6份试液，准确吸取试液2.00、1.00ml于60ml梨型分液漏斗中，用氯仿稀释至10.00ml，按“标准曲线”项操作，在620nm波长处测定吸光度。回收率试验结果为98.40%(RSD= 3.84%，n=6)。

表1 铁皮石斛多糖及生物碱含量(%)

3 结论

本文研究环境及栽培条件一致时，同一种质资源的3年株龄铁皮石斛3月及8月枝条中茎部各部位多糖及生物碱含量的变化。结果表明在同一生长时间的铁皮石斛多糖含量为茎中部最高，其次是茎上部，茎下部含量最低，不同生长时期时多糖含量随生长时间增长而增加，8月枝条含量大于3月枝条，且不同生长时期，不同部位多糖含量差别较大；在同一生长时间内生物碱含量为茎上部最高，其次是茎中部，最低是茎下部，但不同生长时期，不同部位生物碱含量差别较小。

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[2] 张利华.石斛的现代药理学进展[J].内蒙古中医药，2014,33(5):50-50.

[3] 石丽敏，胡贤女，金英燕，等.铁皮石斛的研究现状[J].浙江农业科学，2013(10):1270—1272.

[4] 王伟英，邹晖，陈永快，等.铁皮石斛的综合利用与展望[J].中国园艺文摘，2011(1):189-192.

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[6] 杨家科.龙陵县紫皮石斛标准化栽培技术[J].林业调查规划，2011,36(5):135-139.

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Comparative Analysis on Contents of Polysaccharides and Alkaloids inDendrobiumofficinaleCollected in Various Periods at Longling

WEN Mei-qiong LI Lu YANG Shen-ming XU Cheng-dong DUAN Rui-cai XU Xiao-lin

Department of Chemistry and Life Science, Chuxiong Normal University, Chuxiong 675000, Yunnan, P.R .China

Objective The branches ofDendrobiumOfficinalewith three-year growth period have been collected in 3 or 8, and their contents of polysaccharides as well as alkaloids have been analyzed and compared. Method The branches were processed with solvent extraction, their contents of polysaccharides and alkaloids were determined by spectro- photometry. Results The contents of polysaccharide in various parts of stems ranged from 15.66% to 26.63%, while the contents of alkaloid ranged from 0.016% to 0.021%. Conclusion The polysaccharide content at middle section was the largest, then the upside, and finally the downside, the content increased with the growth period of the branch, and varied greatly according to the growth period as well as section; the alkaloids content at upside section was the largest, then the middle, and finally the downside, but the content decreased with the growth period, and varied little according to the growth period or section.

Dendrobiumcandidum；alkaloid；polysaccharide；content

国家自然科学研究基金项目(31260095)。

文美琼(1963-)，女，副教授，主要从事分析化学教学及天然产物的开发利用工作。

徐成东(1964-)，男，博士，教授，主要从事植物分类和植物地理研究。

【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2015)10-0015-03

2015.02.17)