神经生长因子对颗粒细胞增殖检测方法的探讨

于洋，柳春

（1.辽宁医学院基础医学院 生理学教研室，辽宁 锦州121001；2.辽宁中医药大学基础医学院 生化教研室，辽宁 沈阳110032）

卵巢颗粒细胞（granulosa cell，GC）在生殖过程中起着至关重要的作用。在动物体内，GC既可以营养着卵母细胞，同时又能够促进卵母细胞的发育和成熟。因此，颗粒细胞的增殖分泌功能与卵母细胞的生长和成熟有着非常密切的关系，两者可以形成功能上的一个整体[1]。研究表明，在哺乳动物的生殖系统中发现有神经生长因子（nerve growth factor，NGF）的存在，提示NGF在生殖细胞的分化、发育和生理功能的维持方面具有重要的作用[2]。与胸腺嘧啶结构相似的5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，BrdU），能掺入到S期细胞的DNA合成过程中，掺入合成的程度越强，显示细胞增殖的能力越强，另外还能避免以往应用氚标记的胸腺嘧啶核苷（thymidine，3H-TdR）检测对细胞的放射性损害[3]。细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）中含有2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，经活细胞线粒体脱氢酶还原后生成的黄色甲臜产物，具有高度水溶性，不需要有机溶剂裂解细胞就能够直接进行检测，操作步骤简便，灵敏度高，细胞毒性小。

为了进一步验证NGF的促生殖作用并探索其机制，同时建立一种更有效的卵巢GC体外培养的标记方法，本研究采用分离和培养原代小鼠卵巢腔前颗粒细胞（preantral granulosa cells，PreGC），应用CCK-8分析和BrdU体外标记检测细胞增殖，以探讨NGF是如何影响GC的增殖。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

NGF，RD systems公司；DMEM-F12培养液，Tryple，胎牛血清，双抗，GIBCO公司；BSA，Biotech BASIC INC公司；抗体，Promega公司；CCK-8，Dojindo laboratories公司；BrdU，BrdU in situ defection kitⅡ，BD Biosciences公司。

1.2 实验动物

10 d龄的健康雌性ICR小白鼠，中国科学技术大学生命科学学院实验动物中心[许可证号：SCXK（皖）2005-0008]。

1.3 PreGC的原代培养

小鼠断颈处死后无菌取出双侧卵巢，去除周围脂肪组织及卵巢被膜，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗净卵巢上血污，体视显微镜下用尖头镊子分离腔前卵泡，消化膜细胞5～10min后吸取单个腔前卵泡，2 000 r/min离心5min，弃上清液，加入胰酶消化15min，期间吹打数次，终止消化后离心5min，1 500 r/min，去上清，加入完全培养基制成颗粒细胞悬液，调整细胞密度为2×105个/ml，预接种到培养板中。

1.4 CCK-8检测细胞的增殖

将细胞悬液接种到96孔培养板，每孔100μl，设定NGF分别作用时间为12、24、48、72和96 h的实验组，每个时间段都设定各自的对照组，对照组加入普通培养基，每组设定6个复孔。5%二氧化碳CO2，37℃孵箱培养24 h，细胞贴壁率达到90%，更换含0.1%BSA的DMEM/F12培养基饥饿24 h，加入NGF使终浓度为50 ng/ml，继续培养各个时间段后终止培养，PBS清洗后每孔再加入10μl CCK-8溶液孵育12 h，酶标仪检测450 nm波长的吸光值，计算平均值。

1.5 BrdU体外标记GC增殖

将盖玻片（1.5 cm×1.5 cm）在酒精灯上迅速过火后小心放入24孔培养板中，然后将单细胞悬液滴到玻片上，40μl/滴，然后加培养基到500μl，设定对照组和NGF组（50 ng/m l），每组3个复孔。培养24 h，饥饿后加入NGF使终浓度为50 ng/ml继续培养。

根据细胞生长状况，培养36 h左右适时取出爬片，按照BrdU免疫荧光技术的步骤操作，Hoechst染核，封片后荧光显微镜拍照，随即计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（labeling index，LI，百分数表示）。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 NGF对小鼠卵巢PreGC促增殖作用

50 ng/m l的NGF作用PreGC不同时间段后，采用CCK-8法检测NGF对细胞增殖的作用。结果显示，在波长450 nm时，OD值随作用时间的延长（12～96 h）而增加，当NGF作用48 h时，促增殖作用明显表现出来，同对照组相比，差异有统计学意义（P<0.01），随着NGF作用时间进一步延长，促增殖作用持续存在，同对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2 BrdU的免疫荧光技术检测及LI（%）

BrdU免疫荧光技术检测显示，经50 ng/m l NGF处理36 h后，NGF对小鼠卵巢PreGC已经有促增殖作用，见图2。随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算LI（%），NGF组的BrdU的LI为45.03%，明显高于对照组20.65%（P<0.01），见图3。

图1 不同孵育时间NGF对小鼠卵巢PreGC促增殖作用

图2 NGF刺激小鼠卵巢PreGC 36 h后BrdU免疫荧光技术检测结果 （×40）

图3 NGF对BrdU阳性PreGC标记指数的影响

3 讨论

颗粒细胞是卵巢的主要组成细胞，为卵母细胞的发育提供其所需要的营养物质以及生存的微环境[4]。卵母细胞通过缝隙连接从周围的颗粒细胞中摄取各种营养因子，使卵母细胞的代谢需要得以满足。因此，颗粒细胞在卵母细胞生长中起着重要的营养作用[5]。而且，颗粒细胞与卵母细胞之间的缝隙连接是卵母细胞生长、分裂和成熟能够正常进行的必需因素；同时，卵母细胞对卵泡细胞功能起着中心调节作用[6]。卵母细胞分泌的生长因子对颗粒细胞和卵丘细胞的分化、增生、凋亡和泛素化起着广泛的调节作用，说明颗粒细胞和卵母细胞之间的关系是相互依赖的[7]。颗粒细胞的增殖和分化在原始卵泡形成启动以及以后的卵泡正常发育起着至关重要的作用。因此，颗粒细胞是否能够正常的增殖分化可作为卵泡发育成熟的标志[8]。

最开始的研究显示：NGF的生物学功能仅仅限于神经系统，但越来越多的证据表明NGF也可以作用于其他非神经系统的组织细胞。研究表明，NGF及其受体TrkA和p75在动物的生殖系统中有表达[9]。在猪卵巢中，NGF及其受体在膜细胞和颗粒细胞中都有表达，从而证明NGF及其受体在卵泡发育、排卵等方面都有重要的作用[10]。在金仓鼠的子宫组织中，NGF及其受体TrkA在子宫内膜上皮细胞、腺细胞及基质细胞中都有表达，而p75只在子宫内膜上皮细胞、腺细胞中有表达[11]。对山羊的研究显示NGF及其受体TrkA与p75在输卵管壶腹部与峡部的上皮细胞与肌细胞中有表达[12]。对小鼠和人的卵巢研究也表明，NGF的过表达会导致卵巢中初级卵泡与次级卵泡数量的大幅增加，而裸露的卵母细胞数量相对减少，表明不正常的NGF及其受体水平的增加会造成卵巢囊状疾病[13]。

CCK-8试剂中含有WST-8，它是一种类似于MTT的化合物，在电子载体的作用下被细胞线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。与传统的MTT检测法比较，CCK-8具有使用方便，不需要放射性同位素和有机溶剂，检测快速，灵敏度高，甚至可以测定较低的细胞密度，重复性优于MTT，对细胞毒性小等各种优点[14]。

本实验采用CCK-8试剂盒比较了不同作用时间的NGF对体外培养的小鼠PreGC增殖的影响，选取10 d龄的小鼠，获取PreGC，避免分化的颗粒细胞自身因素对NGF促增殖作用的影响，并且在加入NGF前用无血清培养基饥饿培养，减少其他因素干扰细胞增殖。实验结果证实50 ng/ml的NGF作用颗粒细胞48 h的时候，促增殖作用非常明显地表现出来，随着作用时间延长，呈现一定的时效关系。虽然NGF对细胞的促增殖作用持续存在，但过长的作用时间可能会使细胞的密度太大。因此，判定50 ng/ml的NGF对颗粒细胞的促增殖作用最理想反应时间不能超过48 h。

BrdU作为胸腺嘧啶的类似物，能取代胸腺嘧啶被增殖细胞利用。当细胞处于DNA合成期，即细胞处于增殖期，BrdU被细胞特异性地摄入细胞核掺入到细胞新合成的DNA中，只要细胞存活，这种存留是永久的，用抗BrdU单克隆抗体经免疫荧光技术染色后，可特异性显示BrdU阳性标记细胞，即可直接观察其在细胞内的掺入情况[15]。

本研究采用BrdU体外标记方法，50 ng/m l的NGF作用颗粒细胞36 h后，进行免疫荧光技术检测，结果显示荧光显微镜下可见BrdU阳性标记的颗粒细胞，NGF组的阳性细胞数量明显多于对照组，提示细胞处于增殖期。同时计算BrdU阳性标记指数LI（%），数据显示NGF组的BrdU标记指数明显高于对照组，差异具有统计学意义，这更加直观的表明NGF能够促进颗粒细胞的增殖。

可见，在研究NGF促颗粒细胞增殖及影响因素实验中，采用CCK-8检测和BrdU体外标记的方法是可取的，它们是高效、便捷地标记PreGC增殖的方法，而且本实验结果也证实了NGF促进颗粒细胞增殖是与时间呈时效关系的。

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