山羊痘病毒ORF122 蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

孙剑峰 杨 明 陈伯祥★ 贺泂杰 李 杰

(1.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州 730046；2.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉 744000；3.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州 730050)

山羊痘是由山羊痘病毒（Goatpoxvirus,GTPV）引起的一种急性、热性、接触性传染病，以发热、全身起痘、呼吸道和消化道损伤以及淋巴结肿大为特征。该病的发生对养羊业的发展造成巨大的经济损失，还会影响到国际贸易。

近年来，山羊痘疫情在世界各地尤其东亚地区的暴发流行态势，国内贵州、云南等省也有发病的报道。山羊痘基因组大小为143—147kb。近年来,大量研究证实A33R蛋白是痘病毒的一个重要的免疫保护性抗原,该蛋白可以诱导免疫动物产生针对强毒攻击的保护性免疫反应,其机制是通过抗体依赖的CTL和ADCC作用杀伤痘病毒胞外包膜病毒粒子(extracellularenvelopedvirion,EEV)以及病毒感染的宿主细胞,从而阻止EEV在体内的扩散。基因组学研究和氨基酸序列比较结果表明,GTPVORF122编码产物与痘苗病毒A33R蛋白同源。推测ORF122编码产物是GTPV的主要免疫保护性抗原之一,可能在GTPV的免疫应答中发挥重要作用。由于ORF122蛋白是GTPVEEV囊膜上的糖蛋白,而GTPV在细胞培养物中主要以胞内成熟病毒粒子 (intracellularmature virion,IMV)形式存在,ORF122蛋白在细胞培养物中含量极少。经山羊痘病毒ORF122基因的克隆及免疫原性研究，证实ORF122蛋白能与GTPV阳性血清反应。为此，本研究用表达了山羊痘病毒ORF122蛋白作免疫抗原，构建抗山羊痘病毒ORF122蛋白杂交瘤细胞，制备单克隆抗体，为进一步建立山羊痘的检测方法奠定工作基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与菌株

山羊痘毒株(GTPV-S-1)、羊口疮病毒株、鸽新城疫病毒株、鸡减蛋综合症病毒株、S.enteritidis和E.coli由甘肃省畜牧兽医研究所保存；山羊痘病毒ORF122蛋白抗原由本课题组提供。

1.1.2 细胞株和实验动物

SP2/0细，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；BALB/C小鼠（18—20g、6—8周龄、雌性），购自卫生部兰州生物制品研究所小动物室。

1.1.3 主要试剂

新生牛血清（杭州四季青）、DMEM(GIBCO)、HAT、HT、次黄嘌呤（Solarbio）；胸腺嘧啶核苷（Solarbio）；氨基喋呤（Solarbio）；8-氮鸟嘌呤（Solarbio）；羊抗小鼠IGg-HRP（Solarbio）；PEG1500（Merck）；弗氏完全佐剂（Sigma）；弗氏不完全佐剂（Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 抗山羊痘病毒ORF122重组蛋白杂交瘤细胞的构建

1.2.1.1小白鼠免疫

将纯化的山羊痘病毒ORF122重组蛋白与弗氏佐剂等比例混合、乳化，分别免疫6-8周龄雌性BALB/C小白鼠6只。首免以弗氏完全佐剂乳化抗原，腹腔注射50μg/只0.2mL)；二免，间隔15d，用弗氏不完全佐剂乳化抗原免疫，腹腔注射50μg/只(0.2mL)；三免，间隔时间15d，不加佐剂的ORF122重组蛋白作为免疫原，背部皮下分6点注射，每只100μg（0.2mL）；同时，从尾部尾静脉采血，用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清的抗体水平。小鼠血清效价达到1：4000以上，该小鼠的脾细胞可作用于细胞融合。三免后第3d可进行细胞融合。

1.2.1.2细胞融合

免疫小鼠经眼眶摘除眼球放血，收集血液，拉颈致死后，用75%酒精浸泡消毒，无菌取小鼠脾脏，分离脾细胞，用台朌兰染色计数，按5：1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞（2×107个）混合均匀，1000r/min离心8-10min，去上清，轻弹管底使两种细胞混匀。沿管壁缓慢加入1mL50%的PEG1500，边加边缓慢均匀转动离心管，在60秒内加完。静置90秒，再加入30mL预热的不完全DMEM培养基液终止PEG1500的作用，第1分钟加完1ml，第2分钟内加完1.5mL，第三分钟1.5mL，第四分钟1.5mL，然后再逐渐加快滴加洗液的速度，第五分钟将不完全DMEM培养基加完。37℃水浴5min后1000r/min离心6min。弃上清，加入含1%HAT的DMEM完全培养基，小心吹散混匀细胞，在准备好饲养细胞的96孔板上每孔加入0.1mL融合细胞悬液，最后将融合细胞培养板放置37℃5%的CO2培养箱中培养。

融合后应每日观察细胞的生长情况。骨髓瘤细胞多在融合后2-3d内明显退化，细胞缩小，核浓缩、破碎。巨噬细胞增生、肥大，并开始吞噬细胞碎片。第6d可见克隆状的杂交廇细胞生长。此时观察判断每孔的细胞克隆情况，并作好记录。一般融合后6-7d，每孔移去HAT培养液0.1mL，补加等量的HT培养液。

1.2.1.3筛选和克隆阳性杂交瘤细胞

待融合后的细胞生长到覆盖细胞孔底部1/4—1/3时，细胞生长良好时，可用已建立的间接ELISA方法进行检测上清液中的抗体，取样从含有融合细胞的孔中吸取0.1mL上清，然后原孔内补加等量含1%HT的DMEM完全培养基，同时设阴、阳性对照，阳性对照孔为免疫小鼠的血清，阴性对照为SP2/0细胞上清和阴性小鼠血清，检测为阳性的细胞孔采用有限稀释法进行克隆化培养，阴性孔3d后再检测一次，仍为阴性则弃之。

有限稀释法进行克隆阳性杂交瘤细胞。克隆前一天或当天制备饲养细胞，用1%HT培养液接种到96孔培养板，每孔0.1mL。用含HT的完全培养基将阳性孔中的融合细胞轻吹打，吸到24孔培养板孔中，取少量进行细胞计数。用含1%HT的完全培养基稀释阳性杂交瘤至20个/mL，l0个/mL，5个/mL。将稀释好的细胞悬液分别加到有饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔。将培养板置5%CO2，37℃培养箱中培养。观察生长情况，发现污染立即用0.1mol/LNaOH消除污染，4d左右确定单克隆细胞株并半量换液一次培养。待克隆细胞生长至8—10d时，细胞长满孔底大概1/10，检测上清，标出阳性孔。将两次检测OD492值高的孔进行对照，再取该细胞计数进行下一轮的有限稀释和克隆化培养，如此进行3次克隆和亚克隆，直到所有的孔都为阳性。最后选择OD492值高、细胞活力好的细胞孔，转入24孔板，继而转入培养瓶中进行扩大培养，及时冻存。

1.2.2 抗山羊痘病毒ORF122重组蛋白单克隆抗体制备及鉴定

取10周龄BALB/C小鼠，腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡油进行预处理。1周后，将生长良好杂交瘤细胞的细胞轻吹下，收集，1000r/min离心10min重悬于不完全DMEM培养基中，计数并调细胞数至1.5×106个/mL。每只小鼠腹腔注射0.5mL。待小鼠腹部膨大，用注射器采集腹水，将腹水3000r/min离心20min，收集上清并进行抗体效价的测定，分装-80℃保存

阻断试验：用ELISA方法建立阻断试验来检测McAb特异性。ORF112蛋白作为抗原包被过夜；用PBST洗3次，加小鼠GTPV阳性血清，同时设小鼠GTPV阴性血清对照，37℃作用1h；用PBST洗3次，加纯化的单克隆抗体（腹水），37℃作用1h；用PBST洗3次，加小鼠酶标二抗，37℃作用1h；用PBST洗3次，加显色剂OPD-H2O2,37℃作用20min，加终止液终止反应。在波长492nm测定OD值。判定标准：阳性血清为阴性，阴性血清为阳性，说明此单抗特异。

特异性检测：用间接ELISA方法测定单抗分别与山羊痘病毒、羊口疮病毒、鸽新城疫病毒、鸡产蛋下降综合征病毒、S.enteritidis和E.coli进行交叉反应测定。

2 结果

2.1 杂交瘤细胞的构建

2.1.1 细胞的融合率

细胞融合后3～5天观察，记数细胞板中出现杂交瘤细胞的孔数量，除以细胞培养孔总数，计算得到融合率。经计算，GTPV-ORF122蛋白原核表达产物免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合率为78.6%。

2.1.2 阳性杂交瘤细胞的筛选与建立

在细胞融合后加入1%HATDMEM选择培养基，使96孔细胞培养板中未融合的细胞（脾细胞和SP2/0细胞）全部死亡，经数次半量换培养液，致原来脾细胞分泌的抗体完全消失。当融合细胞集落生长到孔底的1/4～1/3，一般在换液后3～4天或待细胞培养液发黄时吸取杂交瘤细胞培养液上清，利用已建立的间接ELISA筛选方法进行检测，选择OD492nm值高、细胞状态好的杂交瘤细胞孔进行克隆，至少需经过3次亚克隆。GTPV-ORF122原核表达产物免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，以GTPV-ORF122重组蛋白作为抗原，用建立的间接ELISA方法对筛选的强阳性杂交瘤细胞孔进行3次克隆，获得6株能稳定分泌抗GTPV-ORF122蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名ORF122-1A3、ORF122-2C6、ORF122-2B5、ORF122-2G7、ORF1 22-3E7和ORF122-3F3。

2.2 单克隆抗体及杂交瘤细胞的鉴定

2.2.1 单克隆抗体的鉴定

2.2.1.1杂交瘤细胞培养上清及腹水抗体效价的测定

以GTPV-ORF122重组蛋白为检测抗原，分别对6株杂交瘤细胞培养上清液及所获腹水进行检测，同时以SP2/0细胞上清液和SP2/0细胞制作的腹水作为阴性对照，间接ELISA检测上清和腹水抗体效价，结果见表1。

表1 杂交瘤细胞培养上清及腹水抗体效价的测定结果

2.2.1.2McAb的特异性鉴定

2.2.1.2.1ELISA阻断试验

GTPV羊的阳性血清阻断了McAb与GTPV-ORF122蛋白的反应,底物几乎不显色；GTPV羊的阴性血清未阻断McAb与GTPV-ORF122蛋白的反应,底物显色。试验结果表明，所制备的McAb具有特异性。

2.2.1.2.2交叉反应试验

ELISA检测结果表明,McAb只与GTPV反应,而与Orf、EDS-76、鸽新城疫、S.enteritidis、E.coli均不发生交叉反应。

3 讨论

近年来,针对痘苗病毒的大量研究证实,B5R、A33R等EEV囊膜蛋白在痘病毒免疫中发挥着不可缺少的作用,联合接种IMV和EEV蛋白能使免疫动物完全抵御强毒的攻击[1,2]。由于GTPVORF122编码产物与痘苗病毒A33R蛋白同源，可能是GTPV的一个重要的免疫保护性蛋白。李春艳等人研究初期曾试图原核表达ORF122全长蛋白,反复优化条件未能表达出目的蛋白；在明确ORF122基因编码产物存在跨膜结构域后,截去结构域实现了该蛋白以截短体的形式高效表达；还证实所表达的融合蛋白能与GTPV阳性血清反应,表明删除跨膜域并没有影响ORF122 蛋白的天然抗原位点,其仍具有良好的生物学活性[3]。本研究所用的山羊痘病毒ORF122蛋白，也是ORF122基因截去跨膜区实现了原核表达所产生的。

本研究构建了抗山羊痘病毒ORF122杂交瘤细胞6株，细胞上清液抗体效价达1：256以上，腹水抗体效价达1：104以上。本研究制备的单克隆抗体，可用于山羊痘病毒抗原、抗体检测提供了良好的生物材料。