三聚氰胺联合三聚氰酸对攻毒大肠杆菌小鼠抵抗力的影响

王 欣，李化生，王文超，刘 娇，王心竹，尹荣兰,李曦婷，董 俏，田菁菁,尹荣焕

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110161；2.辽宁农业职业技术学院畜牧兽医系, 辽宁 营口115009； 3.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林 长春 130062)



三聚氰胺联合三聚氰酸对攻毒大肠杆菌小鼠抵抗力的影响

王 欣1，李化生1，王文超1，刘 娇1，王心竹2，尹荣兰3*,李曦婷1，董 俏1，田菁菁1,尹荣焕1

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110161；2.辽宁农业职业技术学院畜牧兽医系, 辽宁 营口115009； 3.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林 长春 130062)

试验旨在研究三聚氰胺及其同系物对机体免疫力产生的可能影响，为完善该类污染物的毒理学评价资料提供依据。试验将雄性KM小鼠144只随机分为8组，分别为空白对照组、大肠杆菌阳性对照组，试验组包括三聚氰胺高、中、低剂量组(50 mg/kg、10 mg/kg、2 mg/kg)、三聚氰胺与三聚氰酸联合高、中、低(25+25 mg/kg、5+5 mg/kg、1+1 mg/kg)剂量组，试验组隔天灌胃15 d后，腹腔注射大肠杆菌，48 h后检测小鼠脾脏B淋巴细胞增殖率、血清溶血素光密度值和迟发性变态免疫反应指标。研究结果表明，与对照组相比，当三聚氰胺和三聚氰酸攻毒剂量达到25+25 mg/kg时，B淋巴细胞转化能力下降(0.01

三聚氰胺；三聚氰酸；淋巴细胞转化能力；血清溶血素；抵抗力

三聚氰胺(Melamine，MA)，一种三嗪类含氮杂环有机化合物，因为其含氮量高，有不法分子将其添加到可食用性食品中表观上提高蛋白水平，来通过一些常规测试[1]。三聚氰胺在强酸或强碱溶液中会发生水解，最终生成三聚氰酸(Cyanuric acid,(A))[2]。三聚氰胺和三聚氰酸本身毒性很小，二者联合使用后毒性增加[3]，主要引起动物肾脏毒性[4]。目前，关于三聚氰胺及其与三聚氰酸联合对免疫系统影响的研究报道很少，2004年，Lazarova[5]报道了在83例纺织性皮炎病例中有约20.7%源于对三聚氰胺甲醛和乙烯脲三聚氰胺甲醛过敏的事件，引起作者关于三聚氰胺及其与三聚氰酸联合对动物机体免疫系统危害的思考，本旨在研究三聚氰胺及其与三聚氰酸联合对小鼠抵抗大肠杆菌能力的影响，为三聚氰胺和三聚氰酸的免疫毒理学评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

健康昆明系SPF级雄性小鼠 ，18～22 g，共144只。购自辽宁本溪长生生物科技有限公司,实验动物许可证号：SCXK(辽)2010-0001。Yac-1细胞购自中科院细胞库；绵阳红细胞购自浙江玉环县南方试剂厂。大肠杆菌CMCC44102冻干粉购自辽宁省食品药品监察所。

1.2 药品及试剂

三聚氰胺(北京国药集团)、三聚氰酸(上海晶纯实业)、淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物科技有限公司)、MTT(sigma)、 刀豆蛋白(sigma)、LPS(sigma)、都氏液(碳酸氢钠1.0 g、氰化钾0.05 g、高铁氰化钾0.2 g、蒸馏水加至1000 mL)、豚鼠补体(浙江玉环县南方试剂厂)等。

1.3 分组未提高添加了实际剂量

1.3.1 小鼠试验分组 144只雄性试验小鼠随机分为3批，每批48只，分别用于检测血清溶血素光密度值、迟发性变态免疫反应、T细胞和B细胞转化率。每批小鼠又分为8组，每组6只，试验小鼠分组及处理情况见表1。

1.3.2 大肠杆菌的培养、计数和浓度稀释 大肠杆菌冻干粉复苏、传代培养后将菌液进行倍比稀释，用平板稀释计数法将浓度调整为3×109cfu/mL。 试验组隔天灌胃，试验15 d后，试验组和大肠杆菌阳性对照组腹腔注射3×109cfu/mL浓度为大肠杆菌0.2 mL,48 h后测定胸腺、脾脏指数，同时检测其它指标。

表1 试验分组及处理

1.4 试验方法

1.4.1 血清溶血素光密度值的测定 将绵羊红细胞(SRBC)用生理盐水洗涤3次，每只鼠腹腔注射2%压积SRBC0.2 mL，2 d后，小鼠眼球采血，收集血清。PBS缓冲液稀释100倍，取1 mL置于离心管，依次加入4%压积SRBC 0.5 mL，补体1 mL(稀释10倍)，另取不加血清的对照管。置37℃水浴锅保温30 min后，冰浴10 min终止反应，2 000 r/min离心10 min，取上清1 mL,加入3 mL都氏试剂，同时取4%SRBC 0.25 mL,加入4 mL都氏试剂，充分混匀，静置10 min，于540 nm处以对照管做空白，分别测定各管吸光度值。

1.4.2 足趾法测定迟发型变态反应 每只鼠腹腔注射2%压积SRBC 0.2 mL，4 d后测定小鼠左后足趾部厚度，于该处皮下注射10%的SRBC40 μL，24 h后测定左后足趾部厚度3次，求平均值，接着求出两次测定的差值。

1.4.3 T细胞和B细胞转化率的测定 小鼠脱颈致死，提取脾脏，分离小鼠脾脏淋巴细胞，台盼蓝染色判定细胞活性在95%以上，将淋巴细胞浓度调至1×106个/mL，取475 μL淋巴细胞加入24孔反应板，分别加入25 μL ConA(相当于5μg/mL)和25 μL LPS(相当于当于20 μg/mL)，设定调零孔，另一孔作为对照孔，加入25 μL1640培养液，置于5%CO2培养箱37℃培养48 h，培养结束前4 h，加入MTT 5 mg/mL 500 μL,继续培养4 h,培养结束后，将每孔液体全部吸出，1000 r/min离心5 min，弃掉上清液，加入750 μL二甲基亚砜，将蓝紫色颗粒充分溶解，分别取150 μL加入96孔反应板，做5个孔的平行样，用酶标仪以570 nm处测定OD值。

淋巴细胞转化率=(反应孔OD值-调零孔OD值)/(对照孔OD值-调零孔OD值)

1.5 数据处理

采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，以0.01

2 结果与分析

2.1 不同处理组后小鼠的胸腺指数和脾脏指数

小鼠的胸腺指数和脾脏指数见表2。由表2可以看出，不同处理组与空白组和大肠杆菌对照组相比较，小鼠的脾脏指数无显著性差异，混合高剂量组的小鼠胸腺指数要显著低于其他组(P<0.01)。

表2 小鼠的胸腺指数和脾脏指数

注：A表示与空白对照组比较，P<0.01,B表示与大肠杆菌阳性对照组比较，P<0.01。

Notes:Compared with control group, superscript A indicatesP<0.01;compared with control group and E.coil positive control group，superscript B indicates 0.01

2.2 三聚氰胺和三聚氰胺与三聚氰酸混合对小鼠体液免疫功能影响

2.2.1 血清溶血素光密度值 由表3可见，与空白组和大肠杆菌阳性对照组相比较，其他组的血清溶血素光密度值无显著性差异(P>0.05),当三聚氰胺和三聚氰酸混合剂量达到(25+25 mg/kg)时，血清溶血素光密度值明显降低,差异极显著(P<0.01)。

2.2.2 B淋巴细胞转化能力 由表3可以看出，三聚氰胺和三聚氰酸混合高剂量组(25+25 mg/kg)对B淋巴细胞转化能力影响差异显著(0.01

表3 不同处理组的B淋巴细胞转化率和血清溶血素光密度值

注：与空白组和大肠杆菌阳性对照组比较，*0.01

Notes: Compared with control group and E.coil positive control group, superscript * indicates 0.01

2.3 三聚氰胺和三聚氰胺与三聚氰酸联合对小鼠细胞免疫功能影响

2.3.1 迟发型变态反应 不同处理组对小鼠的迟发型变态反应，与空白对照组和大肠杆菌阳性对照组相比，三聚氰胺组随着攻毒剂量的增加，小鼠的足趾部增厚逐级减小，并且，当三聚氰胺试验组的攻毒剂量达到50 mg/kg，三聚氰胺和三聚氰酸混合组攻毒剂量达到25+25 mg/kg、5+5 mg/kg时，小鼠的足趾增厚明显减小，差异极显著(P<0.01)，见表4。

2.3.2 T淋巴细胞转化能力 不同处理组对由ConA诱导的T淋巴细胞转化能力差异不显著P>0.05)，但是与对照组相比较，三聚氰胺组与三聚氰胺和三聚氰酸混合组都是随着攻毒剂量的逐渐增加，T淋巴细胞能力在逐渐减弱，说明小鼠的T淋巴细胞增值能力与三聚氰胺和三聚氰酸的攻毒浓度紧密相关，有浓度依赖性。这说明三聚氰胺和三聚氰酸的浓度对T淋巴细胞增值能力的影响是非常重要的，是呈趋势变化的，见表4。

表4 不同处理组T淋巴细胞转化率和小鼠足趾部增厚

与空白组和大肠杆菌阳性对照组比较，**P<0.01。

Notes: Compared with control group and E.coil positive control group, superscripts ** indicateP<0.01。

3 讨 论

三聚氰胺和三聚氰酸在一定浓度下可以通过氢键结合形成不溶于水的网格结构复合物,并沉积下来[6]。目前毒理学研究结果表明，低剂量的三聚氰胺毒性轻微[7],它的同系物三聚氰酸会增强三聚氰胺的毒性[8]，并且雄性动物比雌性动物更容易发生相关病变[9]，这也是该试验选用雄性小鼠作为试验动物的原因。

免疫系统是动物机体对抗病原微生物如：细菌、病毒等的防卫系统，它是由白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等组成，它可以保护机体免受外来细菌、病毒等病原微生物侵袭[10]，本试验用大肠杆菌感染小鼠，检测发现脾脏指数差异不显著，而三聚氰胺和三聚氰酸剂量达到25+25 mg/kg时，胸腺指数极显著下降(P<0.01)，提示该类物质可能对小鼠胸腺产生影响，当达到一定剂量时，可使小鼠的胸腺发生萎缩。

当用绵羊红细胞(SRBC)刺激动物机体时，动物机体产生抗SRBC抗体(即溶血素)，这种抗体在体外会和补体反应，导致绵羊红细胞发生溶血，释放血红蛋白，所以，试验所测定的光密度值间接反映了溶血素的含量，血清溶血素水平反映了机体体液免疫能力，其产生量与机体体液免疫能力呈正相关。本试验通过对小鼠血清溶血素含量进行检测，在不同三聚氰胺和三聚氰酸攻毒剂量下，抗原SRBC刺激机体产生抗SRBC抗体的含量不同，结果表明，当混合攻毒剂量达到25+25 mg/kg时，血清溶血素含量最少，说明该组对大肠杆菌的抵抗力下降，攻毒使小鼠的体液免疫功能受到抑制。

淋巴细胞在受到特异性抗原刺激后，转化为淋巴母细胞，反映机体细胞免疫功能的水平[11]。淋巴细胞转化率降低表示细胞免疫水平低下。Yoon等[12]研究数据表明给12周龄雌性小鼠日粮中添加少量三聚氰胺导致淋巴细胞数量有所减少，但差异不显著。前期动物试验也观察到三聚氰胺与三聚氰酸混合攻毒组脾脏淋巴细胞细胞核形态不规则，核膜局部水肿，血窦内粒细胞增多[13]。本研究发现三聚氰胺组和混合组的T、B淋巴细胞转化率均降低，而且由T细胞介导的迟发型变态反应试验显示，三聚氰胺组和混合组小鼠的足趾增厚减小，说明SRBC刺激T细胞产生的致敏淋巴细胞数量减少，当抗原SRBC再次刺激小鼠足趾时，肿胀不明显。推测三聚氰胺和三聚氰酸可能不仅破坏了淋巴细胞的结构，而且对其功能也产生一定影响，从而在一定程度上会抑制小鼠的免疫功能。

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Effect of Melamine and its Combination with Cyanuric Acid on theE.coliResistance of Mice

WANG Xin1,LI Hua-shen1, WANG Wen-chao1, LIU Jiao1, WANG Xin-zhu2,YIN Rong-lan3, LI Xi-ting1, DONG Qiao1, TIAN Jing-jing1, YIN Rong-huan1

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShenyangAgriculturalUniversity，Shenyang，Liaoning110866，China；2.DepartmentofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，LiaoningAgriculturalVocationalandTechnicalCollege，Yingkou，Liaoning115009China；3.JilinProvincialAcademyofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，Changchun，Jilin130062，China)

To test the possible effect of melamine and its homologues on the immunity of organism and provide reliable data for supplementing the toxicological evaluation data of such pollutants, the present study divided male KM mice into eight groups: the control group, E.colipositive control group, melamine high (50 mg/kg),medium (10 mg/kg) and low (2 mg/kg) dose groups, melamine and cyanuric acid high(25+25 mg/kg), medium (5+5 mg/kg)and low(1+1 mg/kg)dose groups. The test groups were fed every other day for 15 days and detected the spleen B lymphocyte transformation rate, hemolysin index optical density, etc. 48 hours after the intraperitoneal injection withE.colithereafter. The results showed that compared with the control group,when the agents of melamine and cyanuric acid reached 25+25 mg/kg, B lymphocyte transformation capacity(0.01

melamine; cyanuric acid; lymphocyte transformation capabilities; hemolysin; resistance

2014-09-25，

2014-10-09

国家自然科学基金(31001088)；辽宁省教育厅"优秀人才"支持项目(LJQ2013070)；沈阳农业大学“天柱山英才”项目(2012-4)

王欣(1990-)，女，辽宁普兰店人，硕士生，研究方向：兽医公共卫生学。E-mail:846062867@qq.com

*[通讯作者] 尹荣焕(1976-)，女，河北安国人，博士，副教授，主要研究方向为动物性食品安全与兽医毒理学。E-mail:yinronghuan@163.com

S811.6

A

1005-5228(2015)02-0067-05