草鱼呼肠孤病毒097株L3、M5和S8片段部分编码区的克隆与分析*

闫娜娜，苏建国，雷初朝

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)



草鱼呼肠孤病毒097株L3、M5和S8片段部分编码区的克隆与分析*

闫娜娜，苏建国，雷初朝*

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)可以引发草鱼出血病，给我国淡水渔业造成严重经济损失。GCRV基因组由11个分节段双链RNA组成，研究克隆了GCRV-097株的L3、M5和S8三个片段的部分编码区(CDS)序列，其中L3片段长度为675 bp(JQ782741)，M5片段长度为777 bp(JQ782742)，S8片段长度为785 bp(JQ782743)。同源性比较分析发现，GCRV-097株L3、M5、S8片段与GCRV-II型的代表株GCRV-HZ08相应区域的相似性分别为99.7%、99.4%、89.6%，表明GCRV-097株属于GCRV-II型。该结果为研究GCRV-097病毒株的生物学特性奠定基础，为进一步研究鱼类抗病毒疫苗提供一定的理论依据。

草鱼；GCRV-097株；克隆；GCRV-II型

草鱼出血病是一种高传染性、高致死性的病毒性疾病，其病原为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)，该病毒隶属于水生呼肠孤病毒属(Aquareoviridae)[1]，是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒，也是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株[2]，可导致当年草鱼(Ctenopharyngodonidellus)鱼苗大批死亡，还能感染青鱼(Mylopharyngodonpiceus)、麦穗鱼(Pseudorasboraparva)和稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)[3]。

GCRV病毒粒子为20面体，5：3：2对称的球形颗粒，直径为65～72 nm，核心直径约为50 nm，无囊膜，具有双层衣壳[4]。其基因组由11条双链分段RNA组成，不同毒株之间病毒基因组的总分子量差异不大(约1.5×106Da)，而各节段分子量有所差异。按分子量大小，11个节段可分为三组，即较大节段(L1, L2, L3)、中等节段(M4, M5, M6)和小节段(S7, S8, S9, S10, S11)[3,5]。除S11外，每个节段只编码1种多肽[6]。

目前已报道的GCRV不同分离株有20多个[7-12]，不同病毒分离株的基因组序列存在变异。根据其序列信息构建的系统进化树，认为草鱼呼肠孤病毒主要有三种基因型：GCRV-I型(代表株为GCRV-873与GCRV-JX09-01)，GCRV-II型(代表株为GCRV-HZ08、GCRV-GD108、GCRV-106、GCRV-918)和GCRV-III型(GCRV-104)。不同类型毒株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均小于30%，而同一类型的毒株其核苷酸和氨基酸序列同源性都大于95%，近年分离的流行株中，以GCRV-II型最为常见[13-14]。

GCRV-097株在武汉分离，其所属的基因型未知。本研究拟从较大节段、中等节段和小节段中分别选取L3、M5和S8片段进行部分编码区序列的克隆，通过比较GCRV-097株不同片段的同源性研究其基因型，为研究GCRV-097病毒株的生物学特性、探讨病毒遗传变异规律等奠定基础，为进一步研究鱼类抗病毒疫苗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

GCRV-097株病毒原液来自中国科学院水生生物研究所。健康草鱼(15～20 g)取自西北农林科技大学安康水产试验示范站。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取与cDNA的制备 在草鱼背鳍、腹鳍注射病毒(0.5～1 ml/每尾)进行人工感染，收集有明显症状的感染鱼，取鳃、肠和脾三个组织。采用Trizol法(Invitrogen公司)提取总RNA。以M-MLV反转录酶(Promega公司)进行cDNA合成，-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计 根据NCBI提供的GCRV-HZ08、GCRV-GD108、GCRV-106、GCRV-918的L3、M5、和S8片段序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物(表1)，南京金斯特科技有限公司合成。

1.2.3 目的片段的扩增 PCR反应在20 μL的体系中进行：cDNA模板1 μL，10×PCR buffer 2 μL，MgCl22 μL，dNTP Mix (10 mM) 0.8 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.8 μL，Taq DNA聚合酶 0.2 μL，ddH2O 12.4 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，X ℃(表1) 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.4 PCR产物的克隆与测序 对目的条带使用胶回收进行纯化，与pMD19-T载体于16 ℃连接过夜。将连接产物转化感受态细胞(E.coliDH5α)，挑阳性克隆送南京金斯特科技有限公司进行测序。

表1 GCRV-097株L3、M5和S8片段引物信息

1.2.5 序列的递交与分析 将测序结果与其他毒株相应序列进行同源性比对，进一步确认目的序列，并递交到NCBI上获取相应的登录号。BLAST分析目的株和数据库中毒株的同源性。用MEGA6软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 GCRV-097株L3、M5和S8片段部分编码区的克隆与分析

利用VF661-VR662，VF663-VR664，VF665-VR666三对引物均扩增得到GCRV-097株L3、M5和S8目的片段(图1A、B、C)。经测序分析，所获得的L3片段长度为675 bp (GenBank登录号：

图1 GCRV-097株L3、M5和S8片段扩增产物电泳图

JQ782741)，M5片段长度为777 bp(GenBank登录号：JQ782742)，S8片段长度为785 bp(GenBank登录号：JQ782743)。其中，该株L3和M5片段长度与HZ08株、106株、918株、GD108株相应片段长度大小基本一致，而S8片段相对这四株病毒在相同位置有一个80 bp的片段缺失(图2)。再次电泳检测(图1D)亦证明该缺失，说明测序正确。

所扩增的L3片段编码VP3蛋白225个氨基酸(GenBank登录号：AFL46389)，M5片段编码VP5蛋白258个氨基酸(GenBank登录号：AFL46390)，S8片段编码VP41蛋白148个氨基酸(GenBank登录号：AFL46391)。

2.2 序列多重比对和分子进化树分析

将GCRV-097株L3、M5和S8三个片段的核苷酸序列分别BLAST分析，发现该株L3片段与918株(KC201179)、106株(KC201168)、HZ08株(GU350742)的同源性均为99%，与GD108株(HQ231200)同源性为98%。该株M5片段与918株(KC201181)、106株(KC201170)、HZ08株(GQ896336)、GD108株(HQ231202)的同源性分别为99%、99%、99%、96%。该株S8片段与918株(KC201184)、106株(KC201173)、HZ08株(GU350745)、GD108株(HQ231204)的同源性分别为99%、99%、99%、97%。

根据L3片段的核苷酸序列构建的系统进化树(图3)，表明GCRV-097与II型毒株(GCRV-HZ08、GCRV-GD108、GCRV-106、GCRV-918)聚为一类，与I型和III型毒株相差较远。同样，根据M5和S8片段构建进化树，得到与L3片段相似的结果。

图2 GCRV-097株S8片段与HZ08株(GU350745)、106株(KC201173)、918株(KC201184)、GD108株(HQ231204)部分序列比对图

图3 GCRV-097株与GCRV-I、II、III三种代表型株的L3片段构建的系统进化树

3 讨 论

GCRV是双链RNA病毒，结构简单，变异迅速，而且病毒基因组是分节段的，造成不同病毒分离株的复杂性和高度可变性。不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、致病力等方面差异较大。GCRV的深入研究有助于更清楚地认识草鱼病毒性出血病，对该病防治具有重要的指导意义。

BLAST分析发现该片段与GCRV-II型代表株的同源性较高。本研究分析了097株的L3、M5、S8三个片段的同源性，发现三个片段与GCRV-II型代表株同源性都高达96%以上，说明097株可能属于II型毒株。进一步分析三个片段的系统进化树(图3)，发现097株与II型毒株聚为一类，表明该株属于GCRV-II型。

S3片段编码VP3蛋白，具有NTPase、解旋酶活性及绑定dsRNA的作用[15]。M5片段编码VP5蛋白，VP5和VP7为病毒外衣壳组分，其作用可能与病毒的侵染与进入细胞方式有关[16]。对于S8编码的蛋白，通过BLAST分析其与VP41同源性较高，而文献报道其编码VP6蛋白[17]。值得注意的是，097株S8片段有一个80 bp的片段缺失，之前研究表明片段8、9和11编码的多肽与病毒衣壳中的多肽在分子量上无完全对应的关系，推测其编码的这些多肽链可能为结构多肽的非成熟中间产物，需要在宿主细胞内通过后加工造成分子量的增大或减小，抑或为非结构多肽，有待于进一步深入研究[5-6]。由于在呼肠孤病毒中，小节段编码的多肽的变异性较大，呈现多样性，出现这种结果是正常的。

4 结 论

本研究成功克隆了GCRV-097株的L3、M5和S8三个片段的部分CDS序列，GenBank收录号分别为L3：JQ782741，M5：JQ782742，S8：JQ782743。通过生物信息学分析表明GCRV-097株属于GCRV-II型病毒。该结果为研究GCRV-097病毒株的生物学特性奠定基础，为进一步研究鱼类抗病毒疫苗提供一定的理论依据。

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Cloning and Analysis of Partial Coding Sequences of Grass Carp Reovirus 097 Strain Genome Segments L3，M5 and S8

YAN Na-na, SU Jian-guo, LEI Chu-zhao*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Grass carp reovirus (GCRV) causes hemorrhagic disease in freshwater fish culture and seriously threatens the production of this economic species. This viral genome is composed of 11 segments of double-stranded (ds) RNA. In this study, we cloned the partial coding sequences of GCRV-097 segments L3, M5 and S8. The obtained segment L3 is 675 bp in length (GenBank accession number: JQ782741), M5 is 777 bp (JQ782742), S8 is 785 bp (JQ782743). BLASTP analysis revealed that the segments L3, M5 and S8 of 097 strain shares 99.7%, 99.4% and 89.6% identity with the corresponding regions of HZ08 strain, suggesting that GCRV-097 strain belongs to type II. This paper may lay a foundation for further researches on the biological characteristics of GCRV-097 strain, and provide theoretical basis for developing antiviral vaccines on fish.

grass carp; GCRV-097 strain; cloning; GCRV genotype II

2014-09-29 [基金项目] 中央高校基本科研业务费专项(QN2009022)

闫娜娜(1987-)，女，河北沧州人，博士生，主要从事水生生物分子免疫学、动物生物技术方向研究。 E-mail：yannana.121@gmail.com

*[通讯作者] 雷初朝(1968-)，男，湖南常宁人，教授，博士生导师，主要从事动物遗传资源研究。E-mail：leichuzhao1118@126.com

S811.6

A

1005-5228(2015)03-0025-04