泡核桃壳提取物体外抗肿瘤作用研究

刘成娇，夏盟恺，李 杨，王 莹

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

漾濞泡核桃（Juglans sigillata）别名漾濞核桃、茶核桃、铁核桃，主要分布于云南、贵州、四川西部、西藏及雅鲁藏布江下游等地〔1〕。《中药大辞典》中记载核桃楸皮和核桃楸果具有清热、解毒、明目和止痛等功效〔2〕。药理活性研究表明胡桃楸的不同部位，包括茎枝、皮、根、叶和核桃青皮的提取物均具有抗肿瘤作用〔3-6〕。而对于核桃成熟果实内皮（核桃壳）的抗肿瘤作用研究较少。云南省大理州漾濞县为核桃之乡，大量种植泡核桃。在核桃仁的深加工中，被废弃的核桃壳大部分被用作农户燃料，造成了资源的极大浪费。本研究观察了泡核桃壳提取组分对3株肿瘤细胞的抑制作用，从而为今后泡核桃壳药用价值的开发提供理论依据。

1 实验材料

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 RPMI-1640、新生牛血清、MTT、PBS购于Beijing solarbio science&technology co.ltd；顺铂（Cisplatin，DDP）购自云南生物谷灯盏花药业有限公司；青霉素、链霉素购自河南新乡华星药厂；二甲基噻唑二苯基四唑溴盐为Amresco公司生产。

1.1.2 细胞株 人卵巢癌细胞SKOV-3、人肝癌细胞HepG-2、人胃癌细胞MGC-803均由中国科学院昆明动物研究所提供。

1.2 仪器 BB16UV/BB5060UV型CO2培养箱为德国Heraeus公司生产；IX-7型倒置相差显微镜为日本Olympus公司生产；IX-31型光学生物显微镜为日本Olympus公司生产；连续波长酶标仪为BIOTek公司生产；METFLERAE240型电子分析天平为梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司生产；1.0R型低温高速离心机为德国Heraeus公司生产。

2 方法

2.1 抗肿瘤活性成分的分离提取 泡核桃壳经10%NaOH浸泡24 h后，用冰醋酸调pH为中性，加2、4、6倍乙醇沉淀得到HTKD（D）、HTKE（E）、HTKF（F）提取物，所占生药百分率分别为7.55%、3.34%和1.32%，精密称取D、E、F组分，用无血清培养基RPMI-1640配制成浓度为300μg/mL的原液，0.2μm微孔滤膜过滤除菌，再倍比稀释成150、75、37.5、18.75 μg/mL药液待用。

2.2 阳性对照药物的配制 阳性药选用DDP，取1 mg/mL的DDP溶于无血清的RPMI-1640中，5倍稀释，终浓度分别为 50、10、2、0.4 μg/mL。

2.3 体外细胞的培养 SKOV-3、HepG-2和MGC-803均用含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。

2.4 改良MTT法测3种不同提取物对癌细胞的影响 取对数生长期的肿瘤细胞（SKOV-3、HepG-2、MGC-803），将贴壁细胞浓度调整为6×104个/mL，以90μL/孔种入96孔培养板中。同时设立空白组、阴性对照组及阳性对照组（DDP），每组至少设5个复孔。置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，受试组分别加入10μL不同浓度的样品。加药后将96孔板置37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，弃培养液，PBS洗板3次，再加90μL含5%血清RPMI-1640培养液，同时每孔加10μL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h后，弃去培养液，每孔加100μL DMSO溶解，570 nm波长下测定吸光度值（OD）。

2.5 数据处理 计算核桃壳3个组分在不同测试浓度下OD值的均数及标准差，并用下述公式计算细胞的抑制率。细胞抑制率=（对照组OD值-给药组OD值）/对照组OD值×100%，细胞的半数抑制浓度（IC50）值由GWBASIC软件计算得到。SPSS分析量效相关系数。

3 结果

3.1 核桃壳提取物对3株肿瘤细胞作用24 h时的半数抑制浓度 与阳性对照药顺铂相比较，核桃壳提取物 D、E、F对肿瘤细胞SKOV-3、HepG-2 和MGC-803均有一定的抑制作用，但作用较弱，IC50值均远远大于阳性药，差异有统计学意义（P＜0.01），其中提取物D对HepG-2的作用呈双向性，因而未能求得IC50值。在3个组分中核桃壳提取物E对3株肿瘤细胞的IC50值均最小。见表1。

表1 核桃壳提取物D、E、F对3株肿瘤细胞作用24 h时的IC50（±s）

表1 核桃壳提取物D、E、F对3株肿瘤细胞作用24 h时的IC50（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

提取物DDP HTKD HTKE HTKF MGC-803 1.611±0.207 203.119±42.308**125.175±35.200**175.247±23.196**SKOV-3 4.727±0.675 219.712±32.342**147.520±20.336**427.881±60.465**IC50 HepG-2 1.972±0.295—227.163±32.691**342.622±59.747**

3.2 核桃壳提取物对3株人癌细胞作用的量效关系分析 图1～3显示了各组分抑瘤作用的量效关系。作用24 h后，各组分对肿瘤细胞的抑制作用均呈现出良好的剂量依赖性（除了组分D对HepG-2的作用），量效相关系数见表2；随着组分D、E、F浓度的增加，抑制率亦增加。在高浓度（300μg/mL）下，组分E对3株癌细胞的抑制作用优于D和F，对癌细胞的抑制率超过60%。见图1～3。组分D在较低浓度对肝癌细胞HepG-2不仅没有抑制作用，反而表现出促进细胞生长的作用，浓度在75μg/mL时其促生长作用最明显。

表2 核桃壳提取物对3株人癌细胞作用的量效相关系数

图1 核桃壳提取物D、E和F对SKOV-3细胞增殖的抑制作用

图2 核桃壳提取物D、E和F对HepG-2细胞增殖的抑制作用

图3 核桃壳提取物D、E和F对MGC-803细胞增殖的抑制作用

4 结论

实验结果表明，从泡核桃壳中提取得到的3个组分对于不同癌细胞体外增殖均有一定抑制作用，但作用明显弱于阳性对照药顺铂，这可能是由于供试药品均是天然植物药的粗提物，有效成分含量较少所致，另外从组分D对HepG-2的双向作用来看，也可能因为供试药品中抑制和促进肿瘤生长的物质混合存在，因而影响了作用效果。其中组分E对3种癌细胞体外抑制作用较D和F强。E在高浓度（300 μg/mL）时，对3株人卵巢癌细胞SKOV-3、肝癌细胞HepG-2和人胃癌细胞MGC-803的抑制率分别达到了61.83%、62.83%和81.47%，组分E的IC50值也均小于D和F，提示主要药效物质可能存在于组分E中。

提取物D对HepG-2的作用呈双向性，高浓度（300μg/mL）具有抑制作用，当浓度小于150μg/mL时又表现出促进肿瘤生长的作用，周孟清等〔6〕也发现，核桃壳提取物小剂量对小鼠免疫功能有促进作用，大剂量作用反而不明显。这可能是因为天然植物药药效物质复杂、存在某些药效作用相反的成分所致。天然植物药的研究与开发，在资源、能源危机已日益突出的今天，具有广阔的前景和深远的意义。本实验对泡核桃壳的抗癌作用进行初步研究，为其在药效价值的开发利用上奠定实验基础。

〔1〕李寅珊，刘光明，李冬梅.GC-MS法鉴定漾濞泡核桃壳中挥发性化学成分〔J〕.安徽农业科学，2011，39（25）:1527-1528.

〔2〕江苏新医学院.中药大辞典：下册〔M〕.上海：上海人民出版社，1977：1663.

〔3〕文姝，张红梅，金礼吉，等.胡桃楸提取液诱导Hela细胞凋亡的研究〔J〕.中国微生态学杂志，2002，14（2）：81-82.

〔4〕季宇彬，汲晨锋，马宏图.青龙衣冷、热乙醇提取物对H22小鼠肿瘤细胞膜生化功能影响的研究〔J〕.中国中药杂志，2005，30（7）：531.

〔5〕周萍，许兴景，王敏，等.泡核桃壳棕色素的提取和稳定性研究〔J〕.安徽农业科学，2011，39（7）:3912-3913.

〔6〕周孟清，谢申伍，吕治钢，等.薄皮核桃壳醌类物质微波辅助提取及初步小鼠试验〔J〕.饲料工业，2013，34（21）:20-23.