改良CT扫描及CT尿路成像在大鼠膀胱癌动物模型活体检测中的价值

许天源，朱照伟，夏磊磊，王先进，秦 亮，张 祥，沈周俊

（上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科，上海 200025）

膀胱癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国泌尿生殖系统肿瘤中居于首位。动物模型是体内研究膀胱癌发生发展、浸润转移、化疗抵抗机理及新型治疗方法的主要途径，其中使用亚硝基类致癌剂是诱发原位膀胱肿瘤的重要膀胱癌动物建模手段［1］。由于原位膀胱肿瘤生长在肉眼不可直视的膀胱腔内，因此活体检测对动物模型的评价具有重要意义。我们曾在国内首次报道了膀胱癌大鼠的活体CT检测方法，对评判建模效果具有良好的指导价值［2］。尽管如此，这种单纯CT平扫的成像对比度欠佳，且实验动物目标较小，检测灵敏度有待提升。此外CT作为一种平面成像手段，无法提供直观、精准的病灶定位和形态信息。CT尿路成像（CT urography，CTU）作为临床上一种高效的膀胱癌影像学诊断技术，弥补了上述缺点，值得在动物实验中参考。有鉴于此，本课题组提出了一种改良的膀胱癌大鼠CT检测方法，并在此基础上进行了CTU三维重建，取得了很好的检测效果。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 造模试剂N－甲基－N－亚硝脲（MNU）（2g瓶装混合物，纯度50%）购自美国Sigma公司。枸橼酸缓冲液的配置：枸橼酸4.2g，氢氧化钠2.1g，加经高压灭菌的去离子240mL水振摇溶解，用5mol／L浓盐酸调节pH值至6.0，再加去离子水至250mL摇匀，分装、密封后4℃保存。将缓冲液50mL注入MNU瓶中，配置成浓度20mg／mL的MNU溶液，3mL分装后置于－80℃冰箱保存。CT扫描用InveonmicroPET／CT显像仪（西门子公司，德国），检测中使用碘造影剂欧乃派克（通用电气药业上海有限公司，中国）。

1.2 实验动物及模型构建 建模动物选用10～12周龄无特定病原体（specefic pathogen free，SPF）级雌性斯泼累格·多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠，体重190～220g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，由上海交通大学医学院附属瑞金医院实验医学研究中心饲养［SCXK（沪）2011－0113］。饲养条件：SPF级独立盒笼系统，常规饮食，12h昼夜节律，湿度50%～60%，温度24～27℃。整个实验过程，按照实验动物3R原则对大鼠给予人道的关怀，方案经实验动物伦理委员会审核通过。

取大鼠30只随机分为两组，对照组（A组）10只，造模组（B组）20只。A组以枸橼酸钠缓冲液0.1 mL每2周膀胱灌注1次，共4次：每次给药前2%50 mg／kg戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，仰卧固定并消毒会阴，取洁净硬脊膜外麻醉导管（直径1mm，长度6 cm），石蜡油润滑后经尿道置管，尿液流出提示插入膀胱；抽尽膀胱尿液并注入枸橼酸钠缓冲液0.1mL（注射器推至尽头后拔出、抽吸少量空气，再连接导管将导管中的残余液体全部注入大鼠膀胱），拔除导尿管后粗丝线扎住尿道外口，大鼠平卧2h解除丝线等待麻醉清醒。B组以A组同法经膀胱灌注配置好的MNU溶液0.1mL（2mg）。两组大鼠诱癌期结束后均常规饲养，观察大鼠一般情况。

1.3 改良的CT及CTU检测 活体检测在14周时进行。我们在既往大鼠CT检测［2］的基础上，进一步对方法做了改良：大鼠麻醉后经自制导尿管注入1～1.5mL欧乃派克稀释液（100mg／mL）使膀胱充盈，随后固定在CT机上。CT扫描层厚1.5mm，横轴位、矢状位、冠状位均进行扫描。利用上述数据，进一步通过多平面重建、最大密度投影、曲面重建和容积再现等技术，对大鼠的下尿路进行CTU三维重建。

1.4 病理组织学分析 活体检测后（14周末）处死所有大鼠，肉眼观察膀胱成瘤情况；取新鲜膀胱组织，10%甲醛溶液固定24h，脱水，石蜡包埋，切片4～5 μm，HE染色。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0软件处理数据。计量资料采用s进行统计描述。组间比较计量资料采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 实验中，A组大鼠1只因首次膀胱灌注时麻醉过量死亡。B组大鼠死亡2只，1只因首次膀胱灌注时麻醉过量死亡，1只于第6周时死亡，尸体解剖可见肾脓肿形成。两组大鼠平均初始体重相近［（205±10）g vs.（207±11）g］；整个实验过程中大鼠活动正常，14周时A组存活大鼠平均体重略高于B组［（319±15）g vs.（308±21）g］，但差异无统计学意义（P＞0.05）。B组大部分大鼠于第7周后陆续出现肉眼血尿。

2.2 建模效果与病理组织学特征 14周末处死所有存活大鼠。肉眼下A组大鼠均未见成瘤，膀胱黏膜光滑、壁薄、厚度均匀、血管纹理清晰。B组大鼠成瘤17只（94%），膀胱肿瘤呈米粒样、乳头状、菜花状或团块状，膀胱壁可见不同程度的增厚；部分大鼠伴膀胱结石及输尿管积水。所有大鼠均未见肝肾、淋巴结肿瘤转移。

两组大鼠的肉眼及镜下典型组织病理特征如图1所示。A组大鼠膀胱黏膜均为3～4层移行上皮细胞组成，细胞大小均一，排列有序，核圆；B组大鼠成瘤病理类型均为尿路上皮癌，膀胱肿瘤细胞大小不一，层次明显增多，细胞排列紊乱，极性消失，核畸形，染色质呈粗颗粒状，常堆积于核膜下，核浆比例大，可见不同程度的核分裂像。

2.3 大鼠CT检测结果 改良的CT成像如图2所示，膀胱腔内含碘的欧乃派克稀释液呈高信号，与周围中低信号的膀胱壁及肿瘤组织对比鲜明。正常大鼠膀胱内腔呈椭圆形高密度影，边界清晰光整，周围膀胱壁厚薄均一；膀胱癌大鼠可见乳头状、团块状等大小不等的低信号隆起凸向膀胱腔形成充盈缺损，膀胱壁厚薄不均，局部可见增厚。利用该方法成瘤大鼠全部检出，检出率100%。

2.4 大鼠CTU检测结果 利用CT扫描数据，我们进一步进行了大鼠膀胱CTU三维重建（图2）：正常膀胱呈光滑的椭球形，左右输尿管及下方尿道均显影清晰；膀胱新生物表现为椭球表面大小不同、形状各异的凹陷，边界、位置清晰。

图1 两组大鼠膀胱的肉眼及镜下组织病理学特征

图2 两组大鼠CT及CTU图像

3 讨 论

化学致癌法用于原位膀胱癌建模有以下优势：①尿路上皮选择性；②周期短、诱癌率高；③与人类膀胱癌发生的自然规律和病理类型相似；④实验动物要求低［3］。因此该方法在膀胱癌研究中应用广泛，其中MNU为代表的亚硝基类化合物最为常用。MNU是直接致癌剂，通过鸟嘌呤烷化引起DNA损伤诱发膀胱肿瘤，需经尿道膀胱灌注给药，适用于雌性大、小鼠。既往研究采用相同给药方法，膀胱灌注3周出现不典型增生，6～7周出现原位癌，9周可见癌性肿块，12～14周为膀胱乳头状癌或浸润性癌［4－5］。本研究与上述报道一致，14周时大鼠成瘤率94%，镜下新生物为尿路上皮癌，部分肿瘤见肌层浸润，病理特征与人膀胱癌相似。可见MNU诱导大鼠膀胱癌是一种可靠、高效的建模方法。

由于MNU需经膀胱灌注给药，规范化操作对保证建模效果特别重要。实验组非肿瘤因素死亡2例，分别为首次麻醉过量和逆行尿路感染引起的肾脓肿。为了减少意外致死，给药时须注意控制麻醉剂量、防止大鼠窒息；术前器械灭菌、会阴部消毒以减少尿路感染；术中导尿管置入不宜过深，避免粗暴操作损伤尿路；还可经饮水给予大鼠抗生素，不仅可预防感染及膀胱结石，还减少了非尿路上皮肿瘤的发生［6］。另一方面，为了提高成瘤率、减少大鼠成瘤的异质性，也应保证麻醉深度、轻柔置管以减少膀胱收缩，同时术后牢固结扎尿道外口，防止MNU溶液漏出；术前6～8h禁水有利于提高膀胱内MNU的浓度。

由于动物模型建立后常需继续体内实验，因此需要非处死的实验动物活体检测方法来确定建模效果。对于大鼠原位膀胱癌模型，有以下几种可能的方法：下腹部触诊极为简便，但这种方法不能评判膀胱肿瘤的具体情况，且只有质量超过200mg的新生物可被触及，并不可靠［7］；麻醉解剖观察后再缝合，该方法创伤较大，容易导致感染、肿瘤种植甚至致死，对肿瘤特征和后续研究结果也可能产生影响；尿脱落细胞检测无创简便，但阳性率过低［8］；核磁共振也可以用于检测大鼠膀胱肿瘤，但较为昂贵，与CT等方法相比并无明显优势［9］；既往研究还利用SPECT显像进行活体检测，但该方法具有放射性，且耗时较长［5］。我们曾首次报道了CT对大鼠原位膀胱癌检测的价值，该方法直接方便、准确灵敏［2］。尽管小动物CT有较好的检出率，但平扫下膀胱壁及肿瘤组织呈等密度或低密度，与腔内生理盐水暗区对比并不十分明显，对微小病变（0～2mm）的识别效果不能保证。为此我们进一步改良，提出了CT平扫联合碘造影剂膀胱灌注的新方法，大鼠膀胱内腔呈高密度影，与周围膀胱新生物及正常组织对比鲜明，肿瘤边界、位置清晰。这种方法一定程度上弥补了小动物CT空间分辨率低、层厚不足的缺陷，更有利于发现膀胱微小病变（直径1mm的颗粒样肿块），大鼠膀胱癌检出率高达100%，还可利用影像进行肿瘤负荷定量评价。

事实上，本研究中改良CT的鉴定方法与临床CTU检查极为相似。CTU基于图像三维重建技术，正逐步取代传统静脉尿路造影受到医生的青睐。本研究中，我们将复杂的静脉注射造影剂改良为膀胱灌注给药，CT尿路三维重建效果与临床CTU相似，由此提出了一种“小动物CTU”检测方法。通过图像处理软件，可以去除多余骨骼、肌肉及脏器叠影，并对三维图像进行任意旋转，包括输尿管下段、膀胱及尿道在内的大鼠下尿路得到立体呈现；在肿瘤检出方面，CTU弥补了二维平面成像的不足，实现了病灶形态与位置的精确描述，肿瘤负荷也可得到计算。与CT相比，这种方法更为全面和直观，有利于膀胱癌动态生长和治疗效果的连续观测；若今后需开展上尿路或尿道原位肿瘤的动物实验，CTU无疑更具活体检测价值。

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