同位素稀释-气相色谱-质谱法测定发酵乳中氨基甲酸乙酯

李 杰，于瑞祥，许卓妮，李永利，陈 鹰，王 虎

(上海市计量测试技术研究院，上海 201203)



同位素稀释-气相色谱-质谱法测定发酵乳中氨基甲酸乙酯

李 杰，于瑞祥，许卓妮，李永利，陈 鹰，王 虎

(上海市计量测试技术研究院，上海 201203)

建立了同位素稀释-气相色谱-质谱联用测定酸奶、奶酪等发酵乳中氨基甲酸乙酯(EC)含量的方法，通过优化前处理方法，考察了提取溶剂的种类、提取次数对样品提取效果的影响。在优化的实验条件下，使用氨基甲酸乙酯-d5作为内标定量。结果表明：在0.05～20.0 mg/L范围内线性关系良好，线性相关系数为0.999 8，检出限为0.02 mg/L；在3个加标水平下，样品的回收率在98.9%～102.9%之间，相对标准偏差为0.6%～4.8%。该方法前处理简单、提取效果好，具有比外标定量法更好的灵敏度和可靠性，适用于发酵乳中氨基甲酸乙酯含量的监控。

氨基甲酸乙酯(EC)；发酵乳；同位素稀释；气相色谱-质谱(GC/MS)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)又称尿烷，是发酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪、酱油及酒类饮料等)在发酵和储存过程中产生的一种化学污染物。国际癌症研究机构(IARC)将氨基甲酸乙酯列入确认的人类可能致癌物质(2A类)，许多国家也针对其制定了限量标准。我国目前只有出入境检验检疫行业推荐了进出口酒中EC的检测标准[1]，但没有相关的限量法规，对EC的监管仍停留在基础方法研究和食品安全风险监控方面。

目前，对EC的检测方法主要有液相色谱-荧光检测法[2-4]、气相色谱法[5]、气相色谱-质谱法[6-12]、液相色谱-质谱法[13]，目标样品多集中于酒类、酱油等产品，而对发酵乳中EC的研究较少。虽然发酵乳中EC含量比酒类样品中的低，但作为常见的发酵产品，在日常生活中接触很多，存在一定的风险，因此有必要对其进行监控。

本工作主要针对常见的发酵乳进行EC含量检测方法的研究，通过对样品前处理进行优化，采用同位素稀释质谱(IDMS)与气相色谱-质谱(GC/MS)结合的方法，希望获得较低的检出限和较好的回收率，以达到对发酵乳中EC进行有效检测和筛查的目的。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

6890-5975气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司产品，配有电子轰击源(EI)；R-215旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司产品；Milli-Q超纯水器：美国Millipore公司产品；离心机：美国Sigma公司产品；MS1涡旋混合器：德国IKA公司产品。

1.2 主要材料与试剂

乙腈、甲醇、正己烷(色谱纯)：美国Honeywell公司产品；乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、乙醚(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司产品；无水硫酸钠：国药集团化学试剂有限公司产品，于500 ℃烘4 h 以上，冷却后储存于干燥器中，备用。

氨基甲酸乙酯标准品(纯度>99%)：德国Dr. Ehrenstorfer公司产品；氨基甲酸乙酯-d5(EC-d5，纯度≥99.5%，丰度≥99.0%)：上海市计量测试技术研究院产品。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：HP-Innowax毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm)；升温程序：60 ℃保持1 min，以7.5 ℃/min升至180 ℃，再以30 ℃/min升至240 ℃，保持3 min；载气(He)流速1.0 mL/min，压力57 kPa，进样量2.0 μL；不分流进样。

1.3.2 质谱条件 电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；选择性离子监测模式(SIM)；氨基甲酸乙酯定性离子m/z62、74、89，定量离子m/z62；氨基甲酸乙酯-d5定性离子m/z44、64、76，定量离子m/z64；溶剂延迟6 min。

1.4 样品前处理

酸奶：准确称取5.00 g样品于15 mL离心管中，加入100 μL浓度为10 mg/L的EC-d5溶液，再加入5 mL乙酸乙酯，涡旋混匀2 min，以4 500 r/min离心5 min，取上层有机相于梨形瓶中，在下层试样中加入5 mL乙酸乙酯，按上述步骤重复提取1次，合并上层有机相，旋转蒸发至干。准确加入1 mL乙腈，溶解残渣，加入少量无水硫酸钠，混匀。将残渣转移到离心管中，离心，取乙腈层，待测。

乳酪：准确称取1.00 g样品于15 mL离心管中，加入5 mL水超声溶解，再加入100 μL浓度为10 mg/L EC-d5溶液混匀，提取步骤同酸奶。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

由于发酵乳的成分复杂，基质效应明显，需要采用相应的前处理技术进行净化。目前，检测发酵类食品中EC常采用硅藻土净化的前处理方法[14]，该方法不仅处理时间长，而且要消耗大量的试剂。本实验尝试采用溶剂直接萃取的方法，以达到快速、高效的目的。

实验考察了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醚等不同溶剂对发酵乳中EC的提取效果，具体的提取步骤参见1.4节。结果表明，5种提取溶剂与发酵乳均有较好的分层效果，但由于离心后二氯甲烷提取层在底部，获取提取液困难，且易引入误差，不利于实验的进行。外标定量法测定不同溶剂提取回收率实验表明：加标浓度为1.0 μg/g时，乙腈和甲醇只有约50%的回收率；乙醚的回收率略好，为55%；乙酸乙酯的回收率可达80%，具有较高的提取效率。因此，选择乙酸乙酯作为提取溶剂，并分别考察了提取次数对提取效果的影响。实验发现，提取2次与3次获得的回收率结果相近，因此采用2次提取，以节省溶剂和操作时间。

2.2 内标物的选择

由于食品类样品具有基质复杂、待测物提取困难、干扰多等特点，因此，待测物很难从样品中完全提取，采用外标法定量偏差较大，而内标法能够对样品中待测物含量进行有效校正，可以提供更好的检测灵敏度和准确性。有文献报道采用氨基甲酸丁酯作为内标物检测发酵食品中EC含量[7,12]，此内标物具有经济实用的特点。但是鉴于氨基甲酸丁酯与EC 在结构和极性方面存在的差异，在基质、提取液中的分配系数和提取效果也不尽相同，因此作为检测内标时回收率并不理想。同位素标记内标与待测物具有几乎一致的提取回收率、色谱保留特性、溶解性等其他理化性质，

能够有效地校正样品前处理过程中造成的偏差，是最理想的内标物质，相应的同位素稀释质谱法也是目前复杂基质样品中痕量有机物检测较为准确可靠的方法。因此，本实验采用EC-d5作为检测内标物。

2.3 色谱及质谱条件的确定

由于EC含有的氨基具有较高的极性，因此选择极性INNOWAX色谱柱进行分析，实验发现，使用该柱对EC进行分析时，杂质干扰少、峰形对称、灵敏度高。取EC标准品和EC-d5内标进样，获得的全扫描质谱图示于图1。选择灵敏度高且选择性好的m/z62、m/z64碎片离子分别作为氨基甲酸乙酯及其同位素内标物的定量离子，同时选择m/z44、 62、89碎片离子作为EC的定性离子，m/z44、64、76碎片离子作为EC-d5的定性离子。

根据EC质谱图尝试解析了其可能的裂解途径和机理，示于图2。氮带正电荷的自由基离子会发生α断裂生成m/z44碎片离子，或经过氢自由基迁移、逆Diels-Alder重排后生成m/z62碎片离子；氧带正电荷的自由基离子会发生α断裂或α均裂，分别生成m/z74、45碎片离子。因氧元素的电负性强于氮元素，氮正离子较氧正离子的稳定性更好，所以m/z89、62碎片离子的强度和高于m/z74、45碎片离子的强度和；由于m/z62碎片离子可以通过N-C-O的共轭系统稳定正离子，所以具有最高的强度。通过以上裂解途径推测出的EC-d5裂解情况与实际得到的EC-d5质谱图完全相符，验证了本实验所推测的裂解机理。

图1 氨基甲酸乙酯(a)及其同位素内标氨基甲酸乙酯-d5(b)的质谱图Fig.1 MS spectrum of EC(a) and EC-d5(b)

图2 氨基甲酸乙酯可能的裂解途径Fig.2 The proposed fragmentation pathway of ethyl carbamate

2.4 线性范围、检出限

按照本实验条件，分别配制含1.0 mg/L EC-d5内标的0.05、0.2、1.0、5.0、20.0 mg/L系列EC标准溶液，用内标定量法测定。以分析物与内标物峰面积比值(y)对分析物的质量浓度(x)进行线性回归，获得的线性方程为y=1.135 9x+0.034 4，相关系数(R2)为0.999 8。结果表明，在0.05～20 mg/L范围内，EC和EC-d5定量离子的响应峰面积比值与EC的质量浓度有很好的线性关系。以3倍信噪比(S/N)计算EC的检出限为0.02 mg/L。

2.5 检测方法相对标准不确定度的估算

在不确定度的主要影响分量中，内标溶液浓度的不确定度主要由内标标准品的纯度和丰度不确定度、称量不确定度、定容不确定度组成，所以该分量引入的相对标准不确定度为：

2.6 回收率与精密度

在不含EC的发酵乳样品中按照前述方法进行添加回收和精密度实验。在0.1、1.0、10.0 mg/L 3个加标水平下，每个水平做6次平行实验，得到的结果列于表1。由表1可见，同位素标记内标定量法检测EC的回收率在98.9%～102.9%之间，相对标准偏差(RSD)小于5%(n=6)。结果表明，本方法具有很好的准确度和精密度，与使用外标定量法回收率实验结果(约80%)相比，可以明显的体现出同位素稀释质谱法在复杂基质样品中痕量物质检测时前处理简单高效、结果准确可靠的优势。

2.7 实际样品分析

按照实验建立的方法，分别对老酸奶、酸奶和乳酪3种不同的实际样品进行测定，结果列于表2。结果表明，部分样品中检测出极少量的EC，说明发酵乳产品中存在含有EC的风险，鉴于国家尚未出台相应的检测限量标准，对发酵乳制品中EC含量的风险监控非常必要。

表1 加标样品的回收率和精密度(n=6)

表2 实际样品检测结果

注：nd为未检出

3 结论

采用同位素稀释结合气相色谱-质谱联用的方法对发酵乳中氨基甲酸乙酯含量进行定性和定量检测，此方法前处理简单、试剂消耗量少、检测灵敏度高、精密度好、回收完全，能有效地进行发酵食品中氨基甲酸乙酯含量的检测。另外，本研究使用自制的氨基甲酸乙酯-d5稳定同位素标记内标，与进口稳定同位素内标试剂相比，分析成本大大降低，有利于我国摆脱对国外进口试剂的依赖，在一定程度上，对填补我国稳定性同位素化合物制备及其产业化方面的空白具有十分重要的意义。

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Determination of Ethyl Carbamate in Fermented Dairy Products by Isotope Dilution-GC/MS

LI Jie, YU Rui-xiang, XU Zhuo-ni, LI Yong-li, CHEN Ying, WANG Hu

(ShanghaiInstituteofMeasurementandTestingTechnology,Shanghai201203,China)

A method for determination of ethyl carbamate in fermented dairy products was proposed by gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) with deuterium ethyl carbamate as isotopic internal standard. The types and times of extraction solvents were discussed to establish efficient pretreatment method. The results show that the calibration curve has good linearity in the range of 0.05-20 mg/L with the correlation coefficient of 0.999 8, and the limit of detection is 0.02 mg/L. The recoveries range from 98.9% to 102.9% with RSDs of 0.6%-4.8% in three levels. The method is simple, rapid, accurate, and can be applied in the quantification of ethyl carbamate in fermented dairy products.

ethyl carbamate (EC); fermented dairy products; isotope dilution; gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS)

2014-05-30;

2014-09-17

上海市科委科研计划项目 (12142201000)资助

李 杰(1983—)，男(汉族)，甘肃兰州人，博士，从事色谱-质谱联用技术研究和标准物质研制。E-mail: lijie@simt.com.cn

时间：2015-01-30；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20150130.1526.007.html

O657.63

A

1004-2997(2015)03-0268-06

10.7538/zpxb.youxian.2015.0006