过氧化氢增氧引发对烟草种子活力的影响

马文广，利 站，郑昀晔，李 洁，关亚静，胡 晋*

过氧化氢增氧引发对烟草种子活力的影响

马文广1，3，利 站2，郑昀晔1，3，李 洁2，关亚静2，胡 晋2*

（1.云南省烟草农业科学研究院，云南 玉溪 653100；2.浙江大学农业与生物技术学院种子科学中心，杭州 310058；3.玉溪中烟种子有限责任公司，云南 玉溪 653100）

采用液体引发方法，使用过氧化氢为增氧剂，研究了过氧化氢结合GA3引发红花大金元和云烟97种子的效果。利用不同浓度的H2O2结合50 mg/L GA3引发烟草种子，结果表明，含有增氧剂的引发液引发效果更好，显著提高了种子活力。含有较高浓度增氧剂的引发液（GA3+25～100 mM H2O2）引发的烟草种子，种子发芽指数和活力指数显著提高，平均发芽时间显著缩短。GA3+50 mM H2O2引发液引发效果最好，种子活力最高。利用过氧化氢为增氧剂进行引发，可以大大简化引发装置，并取得较好的效果。

烟草；增氧引发；过氧化氢；种子活力

种子引发是提高种子活力的重要方法之一。种子引发是通过控制种子缓慢吸水，让种子进入预发芽状态。引发可促进种子萌发，且提高萌发整齐度，缩短出苗时间，提高幼苗素质和抗逆性，在生产上具有广阔的应用前景。液体引发是将种子置于引发溶液中一定时间后，取出种子回干至原始水分。液体引发操作简便，效果明显，是目前最常用的引发方式之一。

目前，用于种子引发的药剂很多，聚乙二醇、氯化钙、赤霉素等都取得了不错的效果［1］。孙刚［2］利用二甲基亚砜、水杨酸、赤霉素、氯化钙等药剂引发玉米种子，指出赤霉素可以显著提高种子活力指数，并促进玉米幼苗的生长。张彦萍等［3］利用赤霉素对茄子种子引发后，可促进茄子种子活力，提高幼苗抗冷性。赤霉素在烟草种子引发同样取得了良好的效果。聂新柏等［4］利用赤霉素结合KNO3、NaCl等试剂处理烟草种子，打破了烟草种子的休眠并提高种子活力。索文龙等［5］利用不同pH的赤霉素引发烟草种子，发现赤霉素引发显著提高烟草幼苗素质，并且pH偏酸性的赤霉素溶液引发效果更好。

然而，液体引发过程中，种子呼吸代谢旺盛，急剧消耗引发液中的溶解氧，易对种子造成低氧胁迫，为保证引发液具有种子呼吸必需的充足氧气，传统方法是在液体引发过程中配置增氧装置，使用气泵向引发液中通入空气，以缓解种子的低氧胁迫。但是，该方法不仅增加引发成本，还使引发装置变得复杂，不利于引发技术的推广。郑昀晔等［6］尝试使用过氧化钙作为增氧剂对烟草种子进行引发，以替代传统机械通氧，取得一定的效果。但是，上述方法中过氧化钙溶于水后为悬浊液，仍需要不断搅拌，才能使过氧化钙与水充分反应产生氧气，增加额外的劳动力，操作复杂程度不低于机械通氧。此外，过氧化钙溶于水，会产生氢氧化钙，使溶液呈碱性，无法与偏酸性的植物激素（赤霉素的化学结构属于二萜类酸）或化学物质等混合使用，造成过氧化钙增氧具有一定局限性。

过氧化氢水溶液呈弱酸性。过氧化氢在水中缓慢分解［7］，产生氧气（2H2O2=2H2O+O2↑），因此，过氧化氢水溶液富含氧。最近研究表明，过氧化氢具有打破种子休眠的作用［8-10］，其打破种子休眠可能是促进GA合成，促进ABA分解并抑制其合成，从而促进种子快速发芽。这些研究为过氧化氢成为一种对种子有益的增氧剂提供了支持。但目前利用过氧化氢引发种子的研究很少，使用过氧化氢结合植物激素赤霉素引发更是未见报道。本试验利用过氧化氢为增氧剂，结合赤霉素引发烟草种子，试图在简化引发程序、降低成本的同时，找到与常规引发剂如赤霉素等混合引发的最佳方法，提高种子活力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红花大金元（简称红大）、云烟97种子由玉溪中烟种子有限责任公司种子公司提供。赤霉素（GA3）购自美国Sigma公司，纯度为95%。30%的H2O2溶液，购于国药化学试剂公司。

1.2 试验方法

利用9种不同的引发处理进行引发。分别为：（1）水引发，采用机械通气（H2O + O2）；（2）50 mg/L GA3溶液引发，采用机械通气（GA3+O2）；（3）50 mmol/L的H2O2溶液引发（50 mM H2O2）；（4）50 mg/L GA3溶液引发，不通气（GA3+0 mM H2O2）；（5）50 mg/L GA3和10 mmol/L H2O2溶液引发（GA3+10 mM H2O2）；（6）50 mg/L GA3和25 mmol/L H2O2溶液引发（GA3+25 mM H2O2）；（7）50 mg/L GA3和50 mmol/L H2O2溶液引发（GA3+50 mM H2O2）；（8）50 mg/L GA3和100 mmol/L H2O2溶液引发（GA3+100 mM H2O2）；（9）50 mg/L GA3和200 mmol/L H2O2溶液引发（GA3+200 mM H2O2）。未处理的种子为对照（CK）。

烟草种子与引发液为1∶10（g∶mL）比例置于试管中，封口膜密封。在30 ℃条件下引发48 h后，用清水快速冲洗种子，常温通风回干至原来水分。

1.3 溶氧含量的测定

在引发时间为0 h、2 h、6 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h时，利用JPBJ-608便携式溶氧仪测定引发液中的溶氧浓度。

1.4 发芽试验

将引发后的烟草种子置于垫有3层水湿润滤纸的培养皿（直径90 mm）中，在光照培养箱中20～30 ℃（晚上16 h，白天8 h）变温发芽16 d。每个处理采用100粒种子，3次重复。以种子露白为发芽标准，每天记录发芽种子数，第7天计算发芽势（germ ination energy，GE），第16天计算发芽率（germ ination percentage，GP）、发芽指数（germ ination index，GI）和平均发芽时间（mean germ ination time，MGT）。计算方法如下：

发芽势（%）=（7 d内种子发芽数/受检种子数）×100%；

发芽率（%）=（16 d内种子发芽数/受检种子数）×100%；

发芽指数=∑（Gt/Dt）；

平均发芽时间（d）=∑（Gt×Dt）/∑Gt；式中，Gt为逐日发芽种子数，Dt为相应发芽日数［11］。

1.5 幼苗素质的测定

16 d发芽结束后，取幼苗用自来水冲洗干净，用滤纸吸干表面水分。每个重复随机选取50株幼苗，在80 ℃下烘24 h后称干重（dry weight，DW）。3次重复。并计算活力指数（vigor index，VI）=GI×苗干重（g）。

1.6 数据分析

利用SAS软件进行统计分析，方差分析前所有结果的百分率数据先经过反正弦转换（y=arc sin［sqr（x/100）］），多重比较采用Lsd方法。

2 结 果

2.1 红花大金元种子引发效果

2.1.1 红花大金元种子引发液中溶氧的变化 红大种子引发开始后，没有H2O2增氧剂的引发液中溶氧含量快速下降，在18 h溶解氧含量降为0 mg/L（表1）。由此可见，种子在引发过程中确实伴随着旺盛的呼吸。含有H2O2增氧剂的引发液，开始阶段，H2O2分解产生氧气的量大于种子呼吸消耗氧的量，随着时间的推移，H2O2分解完毕，引发液中溶氧开始下降。在引发液H2O2浓度低于50 mmol/L时，相同的引发时间引发液中的溶氧含量与H2O2浓度呈正相关，但当H2O2浓度大于50 mmol/L时，相同的引发时间引发液中的溶氧含量变化不大，表明本试验中50 mmol/L的H2O2分解产生的氧气已经能满足种子呼吸的需要。采用机械通氧的引发液溶氧量一直保持饱和状态。

2.1.2 不同引发处理对红花大金元种子发芽及幼苗生长的影响 经过引发的红大种子发芽率、发芽指数和活力指数都显著高于对照（表2），表明引发对提高种子发芽情况有很好的效果。GA3+O2和50 mM H2O2引发后，发芽指数显著高于H2O+O2引发，平均发芽时间也显著短于H2O+O2引发（表2），表明GA3和H2O2均可促进种子萌发。同时，含有较高浓度增氧剂的引发液（GA3+25～100 mM H2O2）较没有增氧剂（GA3+0 mM H2O2）的引发液，种子发芽指数显著提高，平均发芽时间显著缩短。表明含有合适浓度增氧剂的引发液可以取得好的效果。其中，GA3+50 mM H2O2的引发效果最好，种子活力指数显著高于GA3+O2和50 mM H2O2引发处理，表明H2O2除了有增氧效果外，还可能与GA3有协同增效的作用。GA3+200 mM H2O2的引发效果较差，有可能是过氧化氢浓度过高，对种子有一定损害作用。

2.2 云烟97种子引发效果

2.2.1 云烟97种子引发液中溶氧的变化 云烟97种子引发开始后，没有H2O2增氧剂的引发液中溶氧含量快速下降，在24 h溶解氧含量降为0 mg/L（表3）。当H2O2浓度大于50 mmol/L时，相同的引发时间引发液中的溶氧含量变化不大，表明本试验中50 mmol/L的H2O2分解产生的氧气已经能满足种子呼吸的需要。采用机械通氧的引发液溶氧量一直保持饱和状态。

表1 红花大金元种子不同引发液溶氧量的变化 mg/LTable 1 The dissolved oxygen content of different prim ing solutions used for Honghuadajinyuan seeds

2.2.2 不同引发处理对云烟97种子发芽及幼苗生长的影响 经过水引发和GA3+0 mM H2O2引发的云烟97种子，发芽势、发芽率、发芽指数、干重和活力指数与对照均无显著差异（表4）。其余引发处理的种子，发芽势、发芽率、发芽指数都极显著高于对照，发芽时间极显著短于对照。GA3+O2引发后，发芽指数和活力指数都显著高于GA3+0 mM H2O2引发，平均发芽时间也显著短于GA3+0 mM H2O2引发（表4），表明引发液中溶氧含量（表3）对引发效果影响较大。GA3+50 mM H2O2的引发效果最好，种子发芽指数最高，平均发芽时间最短，种子活力指数极显著高于GA 3+O2和50 mM H2O2引发处理，表明H2O2除了有增氧效果以外，还可能与GA3有协同增效的作用。

表2 不同引发处理对红花大金元种子发芽及幼苗生长的影响Table 2 The effects of different prim ing treatments on Honghua Dajinyuan seed germ ination and seed ling grow th

3 讨 论

种子引发是种子增值、提高种子商品性的重要种子处理技术之一［12］。种子引发可以提高种子活力，缩短种子发芽时间，提高出苗整齐率，提高逆境下的成苗率。引发过程中，种子内发生强烈的呼吸代谢，贮藏物质被分解，并为种子萌动提供能量，DNA和mRNA大量合成，一些代谢中关键酶活化［13］。赤霉素作为一种植物生长调节剂已在烟草［4-5］、水稻［14］、茄子［3］等植物种子引发上广泛应用。

表3 云烟97种子不同引发液溶氧量的变化 mg/LTable 3 The dissolved oxygen content of different prim ing solutions used for Yunyan 97 seeds

表4 不同引发处理对云烟97种子发芽及幼苗生长的影响Table 4 The effects of different prim ing treatments on Yunyan 97 seed germ ination and seed ling grow th

引发过程中种子需要大量的氧气去维持内部代谢的正常进行。本研究中，使用50 mg/L GA3溶液、不通气的引发液（GA3+0 mM H2O2），红大种子引发18 h后，云烟97种子引发24 h后，引发液中的溶氧降为0，说明引发过程中种子进行着旺盛的呼吸，并且红大种子呼吸强度高于云烟97种子。同时，该引发液引发效果远低于GA3+O2处理的种子，说明引发液中溶氧含量对引发效果影响很大。所以传统的液体引发过程中，必须配有通气装置，增加了操作难度。而利用过氧化氢进行种子引发，无需额外的通气装置及搅拌工作，大大简化了引发操作程序，有利于引发技术推广。

过氧化氢溶液偏酸性，可增加种皮透性，有利于生长调节剂或营养物质快速进入种子内部。已有的研究报道表明在用GA3处理种子前，先用盐酸或硫酸短时间处理种子，可以促进种子萌发［15］，与本研究结果相似。同时过氧化氢溶液可以抑制种子表面菌类的生长，进一步提高引发效果。

有学者在研究过氧化氢打破种子休眠时［8-10］，指出过氧化氢促进了GA3传号信导。本研究中，GA3+50 mM H2O2的引发效果最好，种子活力指数均显著高于GA3+O2和50 mM H2O2单独引发处理，表明H2O2除了有增氧效果以外，还可能与GA3有协同增效的作用。说明H2O2引发种子，除了作为增氧剂，其本身可能参与一些激素（GA3等）传号信导，从而促进增加一些激素的作用，取得更好的效果，其具体机理仍在进一步研究中。

过氧化氢可与现有引发技术中常用的赤霉素等引发剂引发种子，显著提高种子的引发效果，简化引发的操作程序，具有较好的应用前景。

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Effects o f Oxygen-Increasing Prim ing w ith Hyd rogen Peroxide on Tobacco Seed Vigor

MA Wenguang1，3， LI Zhan2， ZHENG Yunye1，3， LI Jie2， GUAN Yajing2， HU Jin2*
（1. Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences， Yuxi， Yunnan 653100， China； 2. Seed Science Center， College of Agriculture and Biotechnology， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China 3. Yuxi Zhongyan Tobacco Seed Co.， Ltd.，Yuxi，Yunnan 653100，China）

The liquid prim ing method was used to study the effects of hydrogen peroxide， as an oxygen-increasing reagent， used in combination with GA3 priming of Honghuadajinyuan and Yunyan 97 seeds. Different concentrations of H2O2were combined with 50 mg/L GA3 in prim ing tobacco seeds. The results showed that the priming solution contained hydrogen peroxide had better effects w ith significantly improved seed vigor. A fter treating w ith the prim ing solution w ith higher hydrogen oxygen （GA 3+25～100 mM H2O2） concentrations， seed germ ination index and vigor index were significantly increased， and the average germ ination time w as significantly shortened. The highest seed vigor was achieved by seed prim ing w ith GA3 in combination w ith 50 mM H2O2solution. The results suggested that prim ing w ith suitable concentrations of hydrogen peroxide could greatly improve tobacco seed vigor and simplify the device of priming.

tobacco seed； oxygen-increasing priming； hydrogen peroxide； seed vigor

S572.03

1007-5119（2015）05-0008-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.05.002

云南省烟草公司科技计划项目（2013YN10）

马文广（1972-），男，研究员，主要从事烟草品种选育及种子科学方面研究。E-mail：zhongzima@163.com。*通信作者，E-mail：jhu@zju.edu.cn

2015-05-29

2015-10-13