市贩鸡肉中一株肠出血性大肠杆菌O157:H7的分离

蔺 露，姚 璐，孙 燕，谢建华，叶洁莹，张 雪，卢 露

（1.重庆市动物疫病预防控制中心，重庆渝北401120；2.西南大学，重庆北碚400715）

市贩鸡肉中一株肠出血性大肠杆菌O157:H7的分离

蔺 露1，姚 璐1，孙 燕1，谢建华1，叶洁莹1，张 雪2，卢 露2

（1.重庆市动物疫病预防控制中心，重庆渝北401120；2.西南大学，重庆北碚400715）

大肠杆菌O157:H7是一种肠道出血性大肠杆菌（EHEC），属于肠杆菌科埃希菌属，该型具有很强的耐酸和耐低温能力，可产生大量的Vero毒素引起人和动物出现肠出血性腹泻，儿童与老人易感染出现此症；严重时并发肾衰竭，病死率高，具有荚膜、鞭毛和菌毛；其最适生长温度为30℃～42℃，且广泛分布于自然界，人与人之间或人与家畜之间通过粪污染物经口途径传播。继1982年美国首次发生EHEC引起人的食物中毒事件以后，肠出血性大肠杆菌造成的食源性或水源性污染问题正日益严重［1］。

为了解重庆、云南、陕西三省市的屠宰场、超市和农贸市场环境和畜禽肉产品中大肠杆菌O157:H7的污染情况，我们对3个省市12个屠宰场、7个超市和13个农贸市场的769份样品进行了大肠杆菌O157:H7的分离与鉴定，获得了1株大肠杆菌O157:H7菌株，命名为WL05D01。

1 材料与方法

1.1 样品采集2014年我们从重庆市的合川、江津、万州、黔江、长寿、武隆以及陕西省的西安和云南省昆明采集样本共769份，其中来自屠宰场、农贸市场、超市的猪肉样品有173份、鸡肉样品184份、环境拭子样品412份，见表1。

表1 大肠杆菌O157:H7样品采集与分布

1.2 仪器与试剂生物学显微镜；梯度PCR仪；Ⅱ级生物安全柜等。Dynabeads anti-E.Coli O157（IMPs）和OXOID药敏纸片，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；大肠杆菌O157显色培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司和博赛生物技术股份有限公司；API-20E，购自法国生物梅里埃；大肠埃希菌诊断血清，购自宁波天润生物药业有限公司；大肠杆菌O157:H7标准菌株EK274，西北农林大学杨保伟赠。

1.3 大肠杆菌的前期增菌取样品至BPW均质袋，37℃摇床培养4～6 h后；取1 mL培养液加入EC肉汤，37℃培养24 h。

1.4 免疫磁珠与分纯按大肠杆菌O157免疫磁珠试剂盒说明书操作，取经免疫磁珠吸附的菌液在广东环凯大肠杆菌O157显色培养基上划线，37℃培养24 h；挑取可疑菌落划线于博赛科玛嘉O157显色培养基，37℃培养24 h。

1.5 生化鉴定按梅里埃API-20E试剂盒说明书进行可疑菌株的生化试验。

1.6 血清型鉴定O抗原分型，利用玻片凝集试验进行；H抗原分型，利用试管凝集试验进行。

1.7 多重PCR鉴定按照大连宝生物TaKaRa Ex Taq®试剂盒说明书进行。多重PCR引物参照美国FDA提供的大肠杆菌O157:H7诊断引物，其中包括目的基因：stx1、stx2、+93uid A、γ-eae A、ehx A，共5段，详见表2；PCR反应程序为：95℃预变性15 min，95℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，25个循环，最后72℃延伸5 min。PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上110 V电泳30min后观察多重PCR结果。

表2 大肠杆菌O157：H7多重PCR引物

1.8 药敏纸片试验将菌株接种至MH液体培养基中，37℃摇床培养24 h。将菌液比浊为0.5麦氏单位，然后加100μL菌液于MH固体培养基上，用涂布棒涂布均匀后，贴上药敏纸片，37℃培养24 h，观察细菌对药敏纸片的敏感程度，重复试验3次，判定参照美国NCCLS标准。

2 结果

2.1 细菌培养特性经过实验室初筛，我们从来自重庆市武隆县某农贸市场的鸡肉样品中，分离出1株可疑的O157菌株，命名为WL05D01。WL05D01在广州环凯大肠杆菌O157显色培养基上生长呈紫红色，菌落扁平透明，边缘光滑；在博赛科玛嘉O157显色培养基上呈浅红色至浅紫色，中心灰褐色的菌落，经革兰染色，镜检呈革兰阴性，两端钝圆，短小杆菌，大小约为0.5×1～3μm。

2.2 生化试验及血清型鉴定WL05D01能发酵葡萄糖、鼠李糖、密二糖、山梨醇和甘露醇；吲哚试验阳性；V-P试验、柠檬酸盐利用试验阴性；不产生硫化氢（H2S）；O157抗原玻片凝集试验呈阳性；H7抗原试管凝集试验呈阳性。API-20E试剂条结果为典型大肠埃希菌。

2.3 多重PCR样品WL05D01与阳性对照（标准菌株EK274）在584 bp、397 bp、348 bp、252 bp、166 bp处均出现了核酸条带；与stx1、stx2、93ui⁃d A、eae A、ehx A基因片段大小吻合，见图1。

图1 WL05D 01革兰染色镜检（10×100倍）

图2 WL05D01多重PCR电泳图谱

2.4 药敏纸片试验结果按照美国NCCLS标准选择了A组（氨苄西林、头孢噻吩、庆大霉素）、B组（阿米卡星、环丙沙星、青霉素、头孢噻肟、头孢哌酮）和C组（氯霉素、四环素）中共10种抗生素进行药敏纸片试验，WL05D01仅对B组的青霉素出现了耐受。除此之外，WL05D01对苯唑西林、多粘菌素B、红霉素也出现了耐受。

3 讨论

大肠杆菌O157实验室分离鉴定耗时长，目前采用免疫磁珠（IMPs）与胶体金免疫层析法（ICA）能提高大肠杆菌O157的捕获率［2］，此次我们选用大肠杆菌O157:H7显色培养基代替传统SMAC平皿，以及免疫磁珠（IMPs）对大肠杆菌O157进行浓缩捕获，从市贩鸡肉中分离出了1株大肠杆菌O157:H7，检出率仅为0.54%，如果能结合胶体金免疫层析法（ICA）或许检出率会有所提高。

由于大肠杆菌的血清型较多，其中作为食源性能感染人的大肠杆菌O157型的菌株一般都有志贺菌素，但有可能不全［3］，志贺菌素是致使感染患者出现出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征的主要致病因子［4］。丁红雷等［5］2006年调查结果称，重庆市和三峡库区从猪粪便样品中分离的大肠杆菌O157部分菌株有stx1，所有菌株均缺失stx2；上海赵秋华等［6］从猪场分离的菌株也仅检出出志贺菌素stx1；此次从农贸市场鸡肉样品中分离的菌株WL05D01里stx1和stx2毒力基因都存在，说明从鸡肉中分离的WL05D01有可能是大肠杆菌O157高致病菌株。

根据药敏试验结果，此次分离的WL05D01菌株按NCCLS标准，仅对B组有选择性报告的药物中β-内酰胺类的青霉素耐受；另外对3种抗生素耐受，其中涉及到大环内酯类（红霉素）的耐受，这也与柳巨雄等［7-8］研究结果相同。此次调查样品采集的范围涉及3个省市生猪屠宰场和零售市场，从分离结果来看生猪屠宰场未检出大肠杆菌O157型，从生猪屠宰场、农贸市场、超市采集的各个环节的环境拭子也未能分离出大肠杆菌O157型，但从市贩鸡肉分离出了大肠杆菌O157:H7，证明市贩鸡肉潜在着被大肠杆菌O157:H7污染的风险，为避免受污染的肉品通过食物链进入市场造成食源性疾病的暴发，有关部门应规范家禽宰杀点屠宰检疫。

［1］Riley，LeeW，Remis，etal.Hemorrhagic Colitis Associated with a Rare Escherichia coli Serotype［J］.New England Journal ofMedicine，1983，12（308）：681-685.

［2］Hui Qi，Zhen Zhong，Han-Xin Zhou，et al.A rapid and highly sensitive protocol for the detection of Escherichia coli O157:H7 based on immunochromatography assay combined with the enrich⁃ment technique of immunomagnetic nanoparticles［J］.International Journalof Nanomedicine，2011，6：3033-3039.

［3］A tsushi Iguchi，Hiroki Shirai，Kazuko Seto，et al.W ide Distribu⁃tion of O157-Antigen Biosynthesis Gene Clusters in Escherichia coli［J］.PLoSOne，2011：6（8）：e23250.

［4］Krystle L，Mohawk，Alison D.O'Brien.Mouse Models ofEsche⁃richia coliO157:H7 Infection and Shiga Toxin Injection［J］.J Biomed Biotechnol，2011，2011：258185.

［5］丁红雷.重庆市及三峡库区大肠杆菌O157的流行病学调查［D］.重庆：西南大学，2006.

［6］赵秋华，王少辉，刘萍萍，等.上海市闵行区猪场中大肠杆菌O157：H7的分离鉴定及生物学特性研究［J］.中国动物传染病学报，2013，2l（3）：38.44.

［7］Khana，Das SC，Ramamurthy T，etal.Antibiotic resistance viru⁃lence gene and molecular profiles of Shiga toxin-producing Esch⁃erichia coli isolates from diverse sources in calcutta，india［J］.J Clin Microbiol，2002，40（6）：2009-2015.

［8］柳巨雄.动物源性大肠杆菌O157对β-内酰胺类和氨基糖苷类药物耐药相关机制的研究［D］.吉林：吉林大学，2005.

S852.61+2

B

0529-6005（2015）12-0052-03

2015-08-03

农业部农产品质量安全监管（风险评估）项目（GJFP201500803）

蔺露（1983-），女，兽医师，硕士，主要从事动物疫病防控、实验室细菌学检测，E-mail：yokokiki@foxmail.com