应用病毒计数仪定量检测鸡传染性支气管炎抗原方法的建立

杨小蓉，李浩鹏，张秀美，袁 野，姬书玲

（1.中牧实业股份有限公司，北京丰台100070；2.乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂，河南郑州450061）

应用病毒计数仪定量检测鸡传染性支气管炎抗原方法的建立

杨小蓉1，李浩鹏2，张秀美2，袁 野2，姬书玲2

（1.中牧实业股份有限公司，北京丰台100070；2.乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂，河南郑州450061）

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是危害养鸡业的主要疫病之一，疫苗质量的提升对于该疫病的防控有着至关重要的意义。目前国内对IB疫苗的生产质量控制主要有鸡胚半数感染量（EID50）和动物试验，操作复杂、耗时长、试验受干扰因素多。本研究采用病毒计数仪对IB病毒粒子进行定量检测，同时与EID50检测结果进行对比，本研究方法检测时间只需10min，有耗时短、准确性较高、受干扰因素少的特点，对IB疫苗的生产质量控制提供了较好的方法。

鸡传染性支气管炎；病毒计数仪；定量检测

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis Virus）引起的鸡的一种急性高度接触性传染病，临床以呼吸道症状、产蛋鸡群产蛋率和品质下降、肾病变为主要特征，发病率和死亡率较高，给养鸡业造成了巨大的经济损失［1-3］。IBV血清型众多、不同血清型之间的交叉保护性较差的特点，更增加了防控的难度［3-4］。因此，提高疫苗质量，对于防治IB疫病发生和流行具有重要意义。

目前，国内对IB疫苗的生产质量控制主要有EID50和动物试验，操作复杂、耗时长、试验受干扰因素多。本研究采用病毒计数仪，只需10min，即可对IB病毒粒子进行定量检测，耗时短、准确性较高、受干扰因素少，对IB疫苗的生产质量控制提供了较好的方法。

1 材料与方法

1.1 IB抗原由本实验室保存；鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；ViroCyt病毒计数仪和病毒计数染色试剂盒（Virus Counter Reagent Kit），均购自艾贝泰公司。

1.2 病毒计数仪检测

1.2.1 病毒样品染色（1）将收集的病毒样品在室温下用14 000 r/min离心10min，收集病毒上清用于计数检测；（2）将20μL的病毒上清液加入到180μL的Sample Dilution Buffer中；（3）将Combo Dye工作液混匀，加100μL到200μL上述样品管中；（4）将样品管盖子盖上，彻底震荡混匀；（5）室温放置30min，避光染色；染色完的样品在等待检测过程中，保持避光。

1.2.2 病毒样品检测（1）打开病毒计数仪，进行自动清洗。依次完成ISW液体管、CVF液体管检验，待显示“passed”后，换上PVS液体管；选择“PVS”按钮并显示“successful”后，即可进行病毒样品的检测；（2）再依次ISW液体管、CVF液体管检验并显示“passed”后，装上待检病毒样品，选择“Start Analysis”按钮，开始分析样品，并显示“col⁃lecting Data”。

待检测完成后，保存数据，卸下样品管。再依次ISW液体管、CVF液体管检验并显示“passed”后，即可检测第2个样品。直至病毒检测完后，清洗管道并关机。

1.3 病毒半数感染量检测将病毒悬液作10倍系列稀释，取适宜稀释度，以0.1 mL剂量接种鸡胚。由最高稀释度开始接种，每个稀释度接种6枚，观察并记录鸡胚的病变情况；按中国兽药典（2010年版）计算半数感染量（EID50）。

2 结果与分析

2.1 病毒计数仪检测结果对IB病毒抗原每个浓度梯度的检测均重复3次，活病毒原倍和活病毒5倍的检测结果平均值分别是6.37×108VP/m L和3.3×109VP/mL，呈5倍线性关系。5倍抗原经过灭活前后的平均浓度分别是3.3×109VP/mL和5.77×108VP/mL。

灭活病毒抗原分别浓缩至5、10、20倍，其检测平均浓度分别为5.77×108VP/mL、1.1×109VP/ mL、1.9×109VP/mL，呈线性关系。每个浓度梯度分别重复检测3次，其变异系数范围为3.95%～9.09%，说明该方法成立。

2.2 病毒半数感染量检测结果IB抗原活病毒原倍、5倍抗原检测结果分别是106.63/0.1mL、106.83/ 0.1 mL，即4.3×107EID50/m L、6.76×107EID50/mL。

3 讨论

EID50是在规定时间内，通过指定感染途径，使鸡胚半数感染所需的最小抗原量。EID50检测的是具有感染性的活病毒的数量，并不体现病毒的总浓度（总颗粒数），同时判定鸡胚感染具有主观性。病毒计数仪检测的浓度是所有完整病毒粒子的个数，包括所有具有完整结构的活病毒和灭活病毒，其检测结果客观。因此，活病毒抗原原倍和5倍样品的EID50值分别为4.3×107EID50/m L和6.76×107EID50/mL，病毒计数检测浓度则分别为6.37×108VP/mL和3.3×109VP/mL是合理的。5倍抗原经过灭活前后的平均浓度分别是3.3×109VP/ mL和5.77×108VP/mL，说明灭活对病毒完整性有一定损失，符合生产实际情况。用病毒计数仪分别对每个抗原浓度梯度重复检测3次，其变异系数范围均小于10%，说明该方法稳定性、重复性较好。

表1 病毒计数仪和病毒半数感染量检测

非感染性病毒的数量在总病毒数量中占有一定比例，能影响体内和体外的研究结果。所以快速测定病毒总浓度的方法是非常必要的。在动物疫病的预防和治疗中，采用感染性的方法测得病毒滴度来决定注射的剂量，往往忽视了非感染性的病毒颗粒在动物免疫中的作用和最终疫苗的效果。比如EID50测得病毒浓度为6.76×107EID50/mL，但是病毒总浓度是3.3×109VP/mL，在每一个感染颗粒中，大约有50个颗粒没有被计数，最终可能影响动物免疫结果。

鉴于非感染性病毒颗粒的生物学作用和在疫苗生产中的作用，感染性病毒颗粒和总病毒颗粒的定量检测对于病毒疫苗的生产和研究均十分重要［5-7］，而病毒计数仪在10min内就能快速检测到病毒的总浓度，该方法优势明显。病毒计数仪定量检测IB病毒抗原耗时短、准确性较高、受干扰因素少，广泛应用于病毒的研究和生产中将发挥重大作用，也对IB疫苗的生产质量控制提供了较好的方法。

［1］Promkuntod N，Thongmee S，Yoidam S.Analysis of the S1 gene of the avian infectious bronchitis virus（IBV）reveals changes in the IBV genetic groups circulating in southern Thailand［J］.Res Vet Sci，2015，100：299-302.

［2］安健，田丽英，李焕荣.鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展［J］.中国兽医杂志，2001，37（9）：30-33.

［3］刘胜旺.我国鸡传染性支气管炎流行现状及原因分析［J］.中国家禽，2010，32（16）：5-9.

［4］潘盛，王红宁，周生，等.鸡传染性支气管炎病毒遗传变异研究进展［J］.动物医学进展，2006，27（8）：8-12.

［5］粟硕，张桂红.鸡传染性支气管炎诊断方法研究进展及应用概况［J］.中国预防兽医学报，2013，35（1）：77-80.

［6］刘瑞生，吕永锋，王必慧.鸡传染性支气管炎研究进展［J］.家禽科学，2012（01）：45-50.

［7］王文秀，顾节清，沈志强.鸡传染性支气管炎病毒变异机理及疫苗研究现状［J］.动物医学进展，2010，31（12）：116-119.

Establish themethod of quantitative detection of IBV antigen by Virus Counter

YANG Xiao-rong1，LIHao-peng2，ZHANG Xiu-mei2，YUAN Ye2，JIShu-ling2
（1.China Animal Husbandry Industry Co.Ltd，Beijing 100070，China；2.Zhengzhou Pharmaceutical Factory，Qian Yuan Hao Biological Co.Ltd，Zhengzhou 450061，China）

Infectious bronchitis（IB）is one of themajor disease in poultry industry，and the quality of the vaccine is very im⁃portant to preventand control the disease.At present，quality control of IB vaccinemainly uses egg infectious dose（EID50）and ani⁃mal experiments.Thesemethods are complex，time-consuming，and subject to interference bymany factors.Compared with EID50，method to detect virus particles just needs 10minutes，which is less time consuming，has higher accuracy，and is less affected by disturbances salient features.We hope to provide better quantitative detectingmethod for IB vaccine.

Infectious Bronchitis；Virus Counter；quantitative detection

S852.65+9.5

A

0529-6005（2015）12-0039-02

2015-07-07

杨小蓉（1985-），女，硕士，从事生物制品研究，E-mail：yxr3816@163.com