外源纤维分解酶对玉米秸预处理条件的筛选

赵丽媛，彭永佳，王佳堃，刘建新（浙江大学奶业科学研究所，浙江杭州310058）

外源纤维分解酶对玉米秸预处理条件的筛选

赵丽媛，彭永佳，王佳堃，刘建新*
（浙江大学奶业科学研究所，浙江杭州310058）

试验首先筛选出促进玉米秸发酵的2种最佳酶制剂（试验一），之后分析2种酶制剂的最适预处理时间（试验二）和温度（试验三）。试验一采用单因素试验设计，包括4种纤维素酶（CEL）和4种木聚糖酶（XYL）。试验二和试验三采用二因素试验设计，包括对照组、纤维素酶组和木聚糖酶组3组，其中试验二设3个预处理时间（0、12、24 h），试验三设4个预处理温度（4℃、15℃、25℃、39℃）。利用压力读取式体外产气系统，测定产气量（GP）、干物质（DM）、中性洗涤纤维（NDF）及酸性洗涤纤维（ADF）降解率。结果表明：CEL2和XYL1显著提高玉米秸纤维降解率；预处理24 h的GP、DM、NDF和ADF降解率显著高于0 h和12 h（P＜0.01），XYL和CEL处理显著提高GP和DM降解率（P＜0.05），预处理时间与酶之间没有互作效应（P＞0.05）；GP、DM和ADF降解率以39℃最高（P＜0.01），NDF降解率以25℃最高（P＜0.01），XYL和CEL处理显著提高GP和ADF降解率（P＜0.05），预处理温度与酶对DM和NDF降解率有显著互作效应（P＜0.01）。结果提示，25℃以上预处理24 h，酶制剂预处理玉米秸效果最佳。

纤维分解酶；预处理；玉米秸；纤维降解

2010年我国玉米秸总产量达2.65亿t［1］，而用于动物饲料的不足30%，不少在田间焚烧，造成资源极大浪费的同时引起环境的严重污染。玉米秸的纤维含量高和适口性差是制约其用于动物饲料的主要原因。近年来有研究表明，外源纤维分解酶能够改善纤维消化率，其中以纤维素酶（CEL）和木聚糖酶（XYL）应用最为广泛［2］。

酶的作用效果受到多种因素影响。首先酶对底物具有高度的专一性，要充分发挥酶制剂的作用，就应根据日粮搭配相应的酶制剂。因此，选择与玉米秸发酵最适合的纤维酶是获得最佳处理效果的基础。同时，由于酶解产物达到一定浓度后会对反应过程产生反馈抑制作用，所以合适的催化反应时间也是确保酶发挥高效作用的因素。研究证明，CEL和XYL预处理24 h可以提高青贮玉米和稻草的体外干物质降解率（DMD）和中性洗涤纤维降解率（NDFD）［3-4］，Holtshausen等［5］发现使用液态酶预处理22 h可显著提高苜蓿干草DMD和NDFD，Eun等［6］也发现CEL和XYL预处理18 h可显著提高苜蓿干草体外产气量和有机物降解率，由此可知一定的预处理时间对发挥酶的作用效果很重要。另外，温度也是影响酶作用效果的重要因素，很多研究采用39℃作为预处理温度［3-4］，也有在室温条件下进行［5-6］，发现都可有效改善饲料纤维消化率。Colombatto等［7］提出，温度对酶的效果没有显著影响，这提示预处理温度的高低可能对酶发挥作用没有影响，但是并没有涉及低于室温的预处理温度对酶作用效果影响的研究。因此，关于酶制剂在应用时的预处理条件值得进一步研究。

目前，我国的养殖户往往依据商家建议的添加剂量和方法使用酶制剂，并没有考虑不同地区各个季节的环境温度变化以及酶处理时间等决定性因素的影响，在酶制剂使用效果上就会出现效果差甚至没作用的情况，从而造成经济损失。针对这个问题，本试验利用体外产气法，以玉米秸为底物，首先在实验室前期预处理条件下对8种酶制剂进行初步筛选，之后针对不同时间和不同温度预处理对CEL和XYL作用效果进行研究，为深入探索酶制剂的作用与生产应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 底物玉米秸采集自河北邢台地区，秋季收获。65℃烘干制备风干样，经小型粉碎机40目粉碎，干物质（DM）、粗蛋白（CP）含量按《饲料分析及饲料质量检测技术》方法测定，中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）按Van Soest法测定［8］。

1.2 酶活性和蛋白浓度测定选用的CEL和XYL分别来自于不同酶制剂供应商，模拟瘤胃内环境，在pH 6.6和温度39℃条件下首先以葡萄糖、木糖为底物绘制标准曲线，再分别以羧甲基纤维素钠、纤维素、燕麦木聚糖为底物测定酶的内切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活和木聚糖酶活［9-10］。使用Bradford蛋白定量试剂盒测定酶制剂的蛋白质浓度。测得的酶活和蛋白浓度见表1。

表1 酶制剂酶活性和蛋白浓度

1.3 试验设计

1.3.1 最佳外源纤维分解酶的筛选（试验一）采用单因素试验设计，以玉米秸为底物，通过体外产气法从8种酶制剂中筛选出最佳纤维素酶和木聚糖酶各一种，其中对照组不添加酶制剂，CEL和XYL添加水平分别为30 U/g DM和60 U/g DM［3-4］。

1.3.2 不同预处理时间的效果（试验二）采用3×3二因素试验设计，因素一为处理时间（0 h、12 h和24 h），因素二为酶处理组（对照组CON、纤维素酶组CEL和木聚糖酶组XYL），预处理温度为39℃，CEL和XYL添加水平同上，探究不同预处理时间对玉米秸降解率的影响。

1.3.3 不同预处理温度的效果（试验三）采用4×3二因素试验设计，考虑生产中的实际条件，因素一为处理温度（4℃、15℃、25℃和39℃），分别模拟四季的温度，因素二同上，预处理时间依试验一结果，探究不同预处理温度对玉米秸降解率的影响。

1.4 体外培养程序采用压力读取式体外产气法（RPT系统），使用产气瓶模拟体外瘤胃发酵培养［11］。准确称取0.5 g玉米秸（DM基础）至恒重的ANKOM bag（F57，ANKOM Technology）中，热封口后放入120 mL产气瓶中，在持续通入CO2气流下依次加入提前稀释好的外源酶溶液200 μL和40 mL人工唾液［12］，用橡胶塞密封。依据试验设计进行处理。

次日早晨选取3只体况良好，装有永久瘤胃瘘管的湖羊作为瘤胃液供体。晨饲前经瘤胃瘘管抽取瘤胃液，后经灭菌的四层纱布过滤，准确抽取10 mL瘤胃液接种到产气瓶中，混匀后，于39℃继续培养48 h，整个过程保证无氧。试验重复3次，每次设不加底物的空白组和标准羊草对照，以消除发酵液自身产气以及不同批次引起的差异，每个处理设4个重复。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 pH发酵48 h后终止培养，立即使用SartoriusPB-20型pH计测定发酵液pH值。

1.5.2 产气量（GP）分别记录培养12、24 h和48 h后的压力值，根据下列公式将产气压力转换成产气量［11］：

其中，GPt为底物在t时间段的产气量（mL/g），Pt为t时间段压力值（mPa），V0为产气瓶的体积（mL），101.3为标准大气压（mPa），W为底物干物质重（g）。

48 h产气量为各时间段产气量之和。由于预处理阶段底物降解也产生气体，因此预处理期间的产气量也计入总产气量。

1.5.3 体外降解率发酵终止后，取出产气瓶中ANKOM bag，清水洗涤至无色，65℃烘干48 h至风干样，测定残渣DM、NDF、ADF含量，按照下列公式计算底物DMD、NDFD和酸性洗涤纤维降解率（ADFD）。

1.6 统计分析试验数据采用SAS 9.2软件统计处理，采用单因素、二因素方差分析，Duncan′s法进行多重比较。

2 结果

2.18 种酶制剂对玉米秸体外发酵降解率的影响由表2可知，与对照相相比，CEL 2和XYL 1极显著提高了DMD（P＜0.01），CEL2、CEL 4、XYL 1极显著提高了NDFD（P＜0.01），CEL 1、2、4和XYL 1、3、4极显著提高了ADFD（P＜0.01）。其中CEL2和XYL1分别比对照组的DMD、NDFD和ADFD提高了3.2%、5.3%、5.9%和3.7%、3.0%、4.2%。

表28 种酶制剂对玉米秸秆体外发酵DMD、NDFD、ADFD的影响

2.2 预处理时间对体外玉米秸产气量、降解率的影响由表3可知，各处理组瘤胃发酵液pH值没有差异（P＞0.05），且均处在正常范围内。预处理时间对产气量和降解率均有显著影响（P＜0.05），预处理24 h的GP、DM、NDF和ADF降解率显著高于0 h和12 h（P＜0.01），预处理12 h的ADF降解率显著高于0 h（P＜0.05）；不同酶处理间的产气量和降解率差异显著（P＜0.05），XYL与CEL处理的GP、DM降解率均显著高于对照组（P＜0.05），但2个酶之间没有差异（P＞0.05）。NDF和ADF降解率，XYL显著高于CEL，并显著高于对照组（P＜0.05），但预处理时间与酶之间没有互作效应（P＞0.05）。

2.3 预处理温度对体外玉米秸产气量、降解率的影响由表4可知，各处理组瘤胃发酵液pH值没有差异（P＞0.05），且均处在正常范围内。预处理温度对产气量和降解率均有显著影响（P＜0.05），GP、DM和 ADF降解率以39℃预处理最高（P＜0.01），NDF降解率以25℃预处理最高（P＜0.01）；而对于GP和DM降解率，4℃与15℃、25℃之间差异不显著（P＞0.05）。不同酶处理间的产气量和降解率差异显著（P＜0.05），XYL或CEL处理后的GP、ADF降解率均显著高于对照组（P＜0.05），但2个酶之间没有差异（P＞0.05）；对于DM降解率，XYL显著高于对照组（P＜0.05），而XYL处理的NDF降解率显著高于CEL处理（P＜0.05）。预处理温度与酶对DM和NDF降解率有显著的互作效应（P＜0.01）。

表3 预处理时间对玉米秸48h产气量、干物质与纤维物质降解率的影响

表4 预处理温度对玉米秸48 h产气量、干物质与纤维物质降解率的影响

3 讨论

粗饲料是反刍动物的主体饲料，其降解率为体外发酵最主要筛选指标。在体外培养前对底物进行酶液预处理，酶可以在进入瘤胃之前发挥一定作用，破坏纤维物质结构，提高底物消化率［13］，这种作用相当于在饲喂动物前对饲料进行预处理；同时，酶能与底物之间形成稳定的底物-酶复合物，减缓酶被瘤胃蛋白酶的降解作用［14］。本试验就预处理时间与温度进行研究，试图获得理想的预处理条件。

3.1 玉米秸发酵最适纤维酶酶和底物之间存在特异性，不同来源的酶制剂对不同饲料底物的作用效果不一致。本实验室之前以玉米青贮和稻草为底物，已经筛选出纤维降解能力较强的4种纤维素酶和4种木聚糖酶，酶的最佳添加剂量分别为30、60 U/g DM［3-4］。在前期工作的基础上，本试验将这8种酶作为候选酶，首先筛选出最适合玉米秸发酵的纤维分解酶。结果表明，CEL2和XYL1对玉米秸NDF和ADF的降解率均有最佳的增加效果。有研究指出，体外试验中NDFD提高1%可以引起体内试验中奶牛DMI增加0.17 kg，4%FCM产量增加0.25 kg［15］。提示以NDFD评价纤维酶作用效果对实际生产具有一定指导意义。本试验选择CEL2和XYL1进行预处理时间和温度的后续研究，为这两种纤维素酶在不同环境条件下的应用提供理论支撑。

3.2 预处理时间Díaz等［16］使用纤维素酶预处理6种热带粗饲料24 h后，发现底物有机物消化率显著提高，其中4种粗饲料的NDF降解率显著提高。Llewellyn等［17］发现，使用商业酶预处理雀麦草、小麦秆等纤维类粗饲料24 h可显著提高其DM降解率。Eun等［18］发现，用酶预处理粗饲料20 h可以提高其消化水平，一定程度改变其纤维结构，促进瘤胃微生物对底物的附着与分解。Beauchemin等［14］的研究也强调了酶吸附作用的重要性，指出在饲喂前将酶处理饲料，可以促进酶与底物的吸附从而保护酶在瘤胃中不被降解以达到酶作用发挥最大化。本试验得到了相似的结果，用外源纤维分解酶预处理玉米秸可以改善其DM和纤维物质降解，应该也是基于这一机理。本研究结果表明一定的预处理时间是提高外源酶添加效果的有效途径。

3.3 预处理温度以往报道关于预处理温度对酶的效果不尽一致。Giraldo等［19］报道，在室温条件下预处理含70%干草的高粗料日粮可以显著降低其NDF含量。Schroye等［20］在30℃预处理玉米秸，可有效破坏其木质素结构为易分解的小分子固体颗粒。Yang等［21］的研究发现，在39℃时用多种纤维分解酶预处理玉米秸可潜在提高其纤维降解率。本研究表明，随着温度的升高，底物DM、NDF和ADF降解率在数值上逐步增加，可见保证适宜的预处理温度（至少在室温以上）是维持酶高效作用的基础，同时可以更好地实现饲料能量释放和经济效益最大化。

值得一提的是，在本研究中单个预处理温度条件下，酶添加组与空白对照组的产气量相比只有数值上的增加，在统计上没有显著差异，却显著提高了底物降解率，这在一定程度说明产气量和底物降解率不存在正相关关系，与Menke等［12］报道不一致。此外，由统计结果显示，木聚糖的效果整体优于纤维素酶。提示对于玉米秸来说，本研究选用的CEL可能不是最佳的酶制剂，这和不同的酶与底物之间的特异性有关，有待进一步研究。

4 结论

本研究通过比较两种最佳外源酶制剂在不同预处理时间及温度条件下对玉米秸的纤维降解情况，发现将温度控制在室温以上并保持足够的预处理时间是酶发挥最大作用的适宜条件。综合结果表明，外源酶制剂预处理玉米秸的最优条件为25℃以上预处理24 h。

致谢：感谢国际原子能机构（IAEA）对本试验的支持，感谢浙江大学奶业科学研究所老师、同学对本试验的帮助。

［1］中华人民共和国农业部新闻办公室.全国农作物秸秆资源调查与评价报告［R］.北京：中华人民共和国农业部，2010.

［2］Meale S J，Beauchemin K A，Hristov A N，et al.BOARDINVITED REVIEW：Opportunities and challenges inusing exogenous enzymes to improve ruminant production［J］.J Anim Sci，2014，92（2）：427-442.

［3］陈兴，茅慧玲，王佳堃，等.外源纤维酶制剂对青贮玉米体外发酵特性以及甲烷生成的影响［J］.动物营养学报，2013，25（1）：214-221.

［4］Mao H L，Wu C H，Wang J K，et al.Synergistic effect of cellulase and xylanase on in vitro rumen fermentation and microbial population with rice straw as substrate［J］.Anim Nutr Feed Technol，2013，13：477-487.

［5］Holtshausen L，Chung Y H，Gerardo-Cuervo H，et al.Improved milk production efficiency in early lactation dairy cattle with dietary addition of a developmental fibrolytic enzyme additive［J］. J Dairy Sci，2011，94（2）：899-907.

［6］Eun J S，Beauchemin K A.Assessment of the efficacy of varying experimentalexogenousfibrolyticenzymesusinginvitro fermentation characteristics［J］.Anim Feed Sci Technol，2007，132（3）：298-315.

［7］Colombatto D，Mould F L，Bhat M K，et al.In vitro evaluation of fibrolytic enzymes as additives for maize（Zea mays L.）silage：I.Effects of ensiling temperature，enzyme source and addition level［J］.Anim Feed Sci Technol，2004，111（1）：111-128.

［8］Van Soest P J，Robertson J B，Lewis B A.Methods for dietary fiber，neutral detergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition［J］.J Dairy Sci，1991，74（10）：3583-3597.

［9］Wood T M，Bhat K M.Methods for measuring cellulase activities［J］.Method Enzymol，1988，160：87-112.

［10］Bailey M J，Biely P，Poutanen K.Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity［J］.J Biotechnol 1992，23（3）：257-270.

［11］Mauricio R M，Mould F L，Dhanoa M S，et al.A semiautomatedinvitrogasproductiontechniqueforruminant feedstuff evaluation［J］.Anim Feed Sci Technol，1999，79（4）：321-330.

［12］Menke K H，Steingass H.Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid［J］.Anim Res Dev，1988，28（1）：7-55.

［13］Morgavi D P，Beauchemin K A，Nsereko V L，et al.Synergy between ruminalfibrolyticenzymes and enzymes from TrichodermaLongibrachiatum［J］.J Dairy Sci，2000，83（6）：1310-1321.

［14］Beauchemin K A，Colombatto D，Morgavi D P，et al.Use of exogenous fibrolytic enzymes to improve feed utilization by ruminants［J］.J Anim Sci，2003，81（suppl 2）：E37-E47.

［15］Oba M，Allen M S.Evaluation of the importance of the digestibility of neutral detergent fiber from forage：effects on dry matter intake and milk yield of dairy cows［J］.J Dairy Sci，1999，82（3）：589-596.

［16］Díaz A，Ranilla M J，Giraldo L A，et al.Treatment of tropical forages with exogenous fibrolytic enzymes：effects on chemical composition and in vitro rumen fermentation［J］.J Anim Physiol AN N，2014，DOI：10.1111/jpn.12175.

［17］Llewellyn D A，Marston T T，Teutemacher K L，et al.Evaluation of low molecular weight fractions and crude enzyme preparation from a Trichodermacellulase complex as a treatment for fibrous feeds［J］.Anim Feed Sci Technol，2010，160（1）：39-48.

［18］Eun J S，Beauchemin K A，Schulze H.Use of exogenous fibrolytic enzymes to enhance in vitro fermentation of alfalfa hay and corn silage［J］.J Dairy Sci，2007，90（3）：1440-1451.

［19］Giraldo L A，Tejido M L，Ranilla M J，et al.Effects of exogenous fibrolytic enzymes onin vitroruminal fermentation of substrates with different forage：concentrate ratios［J］.Anim Feed Sci Technol，2008，141（3）：306-325.

［20］Schroyen M，Vervaeren H，Van Hulle S W H，et al.Impact of enzymatic pretreatment on corn stover degradation and biogas production［J］.Biores Technol，2014，173：59-66.

［21］Yang H J，Xie C Y.Assessment of fibrolytic activities of 18 commercial enzyme products and their abilities to degrade the cell wall fraction of corn stalks inin vitro enzymatic and ruminal batch cultures［J］.Anim Feed Sci Technol，2010，159（3）：110-121.

OptimalPretreatment Condition for Exogenous Fibrolytic Enzyme on Corn Stover

ZHAO Li-yuan，PENG Yong-jia，WANG Jia-kun，LIU Jian-xin*
（Institute of Dairy Science，Zhejiang University，Zhejiang Hangzhou 310058，China）

The objective of this study was to screen one cellulose（CEL）and one xylanase（XYL）（Trial 1），and evaluate the effects of pretreatment times（Trial 1）and temperatures（Trial 2）forthese two enzymes on corn stover.Trial 1 was conducted according to single factorial design，including 4 CELs and 4 XYLs.Trial 2 and trial 3 were conducted according to a two-way factorial design.Trial 2 involved 3 pretreatment times（0，12 and 24 h）and Trial 2 involved 4 pretreatment temperatures（4，15，25 and 39℃），both trials included 3 enzyme treatments：corn straw as basal substrate without enzyme（CON）or treated with cellulase（CEL）or xylanase（XYL）.In vitro gas test（reading pressure technique）was then employed to determine gas production（GP）and degradation of dry matter（DM），neutral detergent fiber（NDF）and acid detergent fiber（ADF）after 48 h of incubation.CEL2 and XYL1 was screened out according to improved fiber digestion.Compare with pretreatment for 0 or 12 h，pretreatmentfor 24 h significantly increased the GPand degradability of DM，NDF and ADF（P＜0.01），higher value for XYL and CEL on GP and degradability of DM than that of CON（P＜0.05），with no interaction between pretreatment time and enzyme（P＞0.05）.When pretreated at 39℃，GP and degradation of DMand ADF degradation were significantly higher than that of 4，15 or 25℃（P＜0.01），with the highest NDF degradation at 25℃（P＜0.01）.XYL and CEL increased the GP and ADFdegradation（P＜0.05），with significant interactive effects between pretreatment temperature and enzyme on DM and NDF degradation（P＜0.01）.From the above results，it is inferred that corn stover should be pretreated at above 25℃for 24 h in order to obtain an optimal effect from enzyme treatment.

fibrolytic enzyme；pretreatment；corn stover；fiber degradation

S816.9

：A

：0258-7033（2015）19-0049-05

2015-01-22；

2015-04-26

国际原子能机构合作项目

赵丽媛（1988-），女，河北承德人，硕士生，从事反刍动物营养研究，E-mail：zhaoliyuanjuliet@163.com

*通讯作者：刘建新，教授，博士生导师，E-mail：liujx@zju.edu.cn