微卫星荧光标记分析坝上长尾鸡与3个地方品种鸡遗传多样性

2015-04-18关学敏耿立英贺英李祥龙河北科技师范学院河北秦皇岛066004

中国畜牧杂志 2015年19期

关学敏，耿立英，贺英，李祥龙（河北科技师范学院，河北秦皇岛066004）

关学敏，耿立英，贺英，李祥龙*
（河北科技师范学院，河北秦皇岛066004）

为评估坝上长尾鸡保种群的遗传结构和其他地方品种鸡的遗传关系，本研究利用20个微卫星DNA标记，采用微卫星荧光标记与毛细管电泳相结合的方法，检测了4个地方鸡品种共120个个体的遗传多样性。结果表明：20个微卫星位点中有19个微卫星位点均为高度多态，120个个体中共检测到253个等位基因，单个位点的等位基因数从4（MCW0103）～27（LEI0094）不等，平均为12.65。所有位点的平均期望杂合度和平均多态信息含量分别为0.697 5和0.673 6；所有群体均显示较高的期望杂合度，坝上长尾鸡最高，为0.747 2，太行鸡相对比较低，为0.698 0，平均遗传分化系数为0.098，群体内的近交系数为20.4%，杂合子缺失的水平不高；群体的Nei′s遗传距离从0.059 7（广西麻鸡-太行鸡）～0.689 0（北京油鸡-太行鸡）不等。UPGMA系统发生树中，广西麻鸡和太行鸡聚为一类，然后又于坝上长尾鸡聚在一起。北京油鸡独自聚为一类。UPGMA系统发育树结果与这些鸡品种的外貌形态相吻合。

：微卫星标记；毛细管电泳；地方鸡；遗传多样性

坝上长尾鸡是河北省唯一被列入中国畜禽遗传资源志［1］的地方家禽品种，因原产于河北省坝上地区且具尾长特点而得名。坝上长尾鸡目前分布范围变窄，数量急剧减少，作为一个具有适应性强、抗病力强和蛋品质好的优良地方品种，然而由于长期农户散养及缺乏系统选育，坝上长尾鸡产蛋性能较低。所以，在加强坝上长尾鸡保种同时，如何合理利用我国丰富的鸡品种资源来提高坝上长尾鸡的生长发育速度、繁殖力并对其进一步开发利用已迫在眉睫。但是由于当地养殖户保种意识淡薄和外来品种的侵入杂交，使原来的地方品种数量减少，品种纯度下降。因此，对坝上长尾鸡这一品种遗传资源的评估、管理和保护已成为当务之急。

微卫星（SSR）是一种评估品种遗传多样性等研究最有价值的遗传标记。随着大量的微卫星标记在鸡的基因组中被发现，微卫星标记也被广泛应用于鸡群体间和群体内遗传关系的研究［2-6］。SSR这种标记虽然操作简便，但是使用传统的银染法在大规模、多批次的数据收集和分析时存在相当大的难度，采用荧光标记技术，利用ABI3 700 DNA分析仪，克服了银染法的不足，实现了数据收集和处理的自动化［7］。

虽然人们利用微卫星位点对世界各地家鸡的多样性进行研究，对坝上长尾鸡这一地方品种资源的前期研究仅局限于该品种资源的分布和状况的调查，对于这一品种遗传多样性的研究尚未见报道。本研究利用微卫星标记和毛细管电泳相结合的技术对坝上长尾鸡和其他3个地方品种共120个个体进行扫描，对它们之间的遗传多样性和遗传分化进行系统分析，为揭示其遗传关系，尤其是为坝上长尾鸡这一地方品种资源的保种工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料实验所用坝上长尾鸡血样采自河北蛋鸡体系坝上长尾鸡保种群；广西麻鸡血样采自赞皇县许亭乡军营村试验鸡场；太行鸡血样采自赞皇县天然公司太行鸡保种核心群；北京油鸡血样采自北京市农科院北京油鸡保种场，样本数均为30只。

1.2 血液基因组DNA的提取鸡血液基因组DNA的提取采用北京天根血液基因组提取试剂盒提取。

1.3 微卫星引物合成及PCR扩增微卫星引物从国际通用的30对引物中筛选出20对引物，分别为ADL0268、MCW0206、LEI0166、MCW0295、MCW0081、MCW0014、MCW0183、ADL0278、MCW0067、MCW0104、MCW0123、MCW0330、MCW0165、MCW0069、MCW0248、MCW0034、MCW0103、LEI0094、MCW0078、ADL0112。所选引物覆盖所有染色体，表现为多态性好，特异性强且相互之间并不连锁。引物5′端用FAM、HEX、TAM 3种荧光标记，微卫星引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。25 μL反应体系：20 ng DNA模板1μL，10pmol/L正向引物，反向引物各0.5μL，10mmol/L dNTP 0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，水17.8 μL。扩增程序为95℃预变性3 min，95℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，10个循环，第2轮PCR扩增反应程序：95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，20个循环，72℃修复延伸6 min。

1.4 PCR产物的检测第2轮PCR扩增产物经变性处理后用美国ABI公司3730XL测序列分析仪进行毛细管电泳检测，采用Genemapper 4.0软件和GeneScan－500分子内标计算等位基因大小。

1.5 统计分析利用Popgene软件计算等位基因频率、观察杂合度与期望杂合度、F-statistics固定指数等遗传指数；根据PIC-CALC软件计算多态信息含量；群体间的Nei′s遗传距离则由FST值算得；利用PHYLIP3.5软件包，基于Nei′s遗传距离运用UPGMA聚类法构建系统发生树。

2 结果与分析

2.1 群体内的遗传变异4个品种鸡120个个体中共检测到253个等位基因，单个位点的等位基因数从4（MCW0103）～27（LEI0094）不等，平均为12.65。期望杂合度、平均多态信息含量见表1。对于整个群体，所有位点的平均期望杂合度和平均多态信息含量分别为0.697 5和0.673 6。MCW0103位点的期望杂合度和PIC值最低，为0.462 7和0.242 3；而LEI0094位点的期望杂合度和PIC值是最高的，分别为0.915 3和0.865 4。4个群体均显示较高的期望杂合度（表2），坝上长尾鸡最高，为0.747 2，太行鸡相对比较低，为0.698 0。

2.2 群体间的遗传分化群体间Nei′s遗传距离从0.059 7（广西麻鸡-太行鸡）～0.689 0（北京油鸡-太行鸡）不等（见表3），广西麻鸡与太行鸡的遗传距离最近，为0.059 7，与北京油鸡的遗传距离最远，为0.623 6。

4个群体20个位点的遗传分化分析结果见表4。整个群体的平均遗传分化系数为0.098，即总的遗传分化中，约有9.8%源于品种间的差异，90.2%源于品种内个体之间的差异；群体内的近交系数为20.4%，杂合子缺失的水平不高，表明坝上长尾鸡这一地方品种具有高度的遗传多样性，有较高的保种潜力，可用于构建核心种质资源群。

2.3 群体间的聚类分析利用Nei′s遗传距离和UPGMA法对4个品种进行了聚类分析（见图1）。广西麻鸡和太行鸡聚为一类，然后又于坝上长尾鸡聚在一起。北京油鸡独自聚为一类。

表1 20个微卫星标记所在染色体、等位基因数、等位基因大小、期望杂合度、平均多态信息含量

表2 4个群体检测到的平均期望杂合度和平均观察杂合度

表3 4个群体间Nei′s遗传距离

3 讨论

3.1 样本量的确定群体遗传检测，检测的样本量越大，实验结果的准确性越高，稀有基因被检出的可能性也越大，而样本的采集受到多种因素的制约，有时还会破坏研究对象。包文斌等［8］研究结果表明，当样本量超过20个时，期望杂合度的值趋于稳定，才能保证在95%的情况下检出所有等位基因。本研究所选择微卫星座位的数目为20个，实验样本数每个群体为30个，均达到对家养动物遗传多样性检测的要求，可以很好地反映坝上长尾鸡保种群遗传多样性的现状。

表4 F-statistics统计分析结果

图1 4个品种的UPGMA/DA聚类

3.2 品种内遗传多样性分析本研究检测的20个微卫星座位中，19个微卫星座位属于高度多态座位，只有1个座位MCW0103属于低度多态座位，为0.242 3，而且群体平均多态信息含量为0.673 6，平均等位基因数为12.65，平均期望杂合度为0.747 2，显示出丰富的遗传多样性和较高的选择潜力。这说明本研究所选择的20个微卫星位点所提供的多态信息含量丰富，样本数量合理，用其分析遗传多样性具有较高的有效性和可靠性。

本研究所研究的4个鸡品种中，坝上长尾鸡的遗传多样性最高，为0.747 2。太行鸡的遗传多样性相对较低，为0.698 0，这与实际情况是一致的。坝上长尾鸡近年来才开始进行系统选育，群体的整齐度较差，而太行鸡（河北柴鸡）主产于河北省境内太行山沿线等地，经长期自然选育而成的蛋肉兼用型地方品种。太行鸡养殖已从群众自发散养发展到规模养殖，初步形成了太行鸡规模化和生态化养殖［9］，所以群体的整齐度较好。这也说明坝上长尾鸡保种群具有丰富的遗传多样性和较高的选择潜力，这与坝上长尾鸡保种群群体PIC整体上为高度多态性结果是一致的。同时也说明采用的保种方法效果明显，有效的保存了群体的遗传变异。

3.3 品种间的遗传分化本研究的4个地方鸡品种聚为3类。广西麻鸡与太行鸡的遗传距离最近，在聚类分析中聚为一起。广西麻鸡的特征可概括为“一麻、两细、三短”。一麻是指鸡体羽以棕黄麻羽为主；两细是指头细、胫细；三短是指颈短、体躯短、胫短［10］；太行鸡（河北柴鸡）的特征性状表现为：毛色花各色各异，不是纯粹一色，体型好，青脚细腿，大小适中［11］。这2个地方品种的羽色、形态较相近，聚类分析中首先聚在一起，然后又与坝上长尾鸡聚在一起，坝上长尾鸡采样时也是以麻羽为主［12］；北京油鸡的毛色是纯色［1］，在聚类分析中，独自聚为一类。UPGMA系统发育树结果与这些鸡品种的外貌形态相吻合，同时这也说明微卫星标记分析鸡品种亲缘关系的可靠性。

4 结论

本研究检测的20个微卫星位点中，19个位点具有较高的多态性，各群体均显示较高的期望杂合度，坝上长尾鸡最高，为0.747 2，太行鸡相对比较低，为0.698 0。整个群体总的遗传分化中，约有9.8%源于品种间的差异，90.2%源于品种内个体之间的差异。群体内的近交系数不高，表明坝上长尾鸡这一地方品种具有高度的遗传多样性，有较高的保种潜力，可用于构建核心种质资源群。聚类结果与这些鸡品种的羽色等外貌形态基本吻合。这也说明微卫星标记分析鸡品种亲缘关系的可靠性。

［1］国家畜禽遗传资源委员会组编.中国畜禽遗传资源志（家禽志）［M］.北京：中国农业出版社，2011.

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［8］包文斌，束婧婷，许盛海，等.样本量和性比对微卫星分析中群体遗传多样性指标的影响［J］.中国畜牧杂志，2007，43（1）：6-9.

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［12］朱文进，李祥龙，周荣艳，等.坝上长尾鸡保种技术方案［J］.中国家禽，2014，36（4）：46-48.