油菜种子蛋白质提取方法研究

杨

（湖南农业大学农学院，长沙410128）

油菜种子蛋白质提取方法研究

杨柳，李海林，张振乾*

（湖南农业大学农学院，长沙410128）

通过对比改进的Tris-HCl法、酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和DTT/丙酮法4种方法提取油菜未成熟种子蛋白质，以期找到合适的蛋白质提取方法。结果表明，TCA/丙酮沉淀法和DTT/丙酮法所得蛋白质沉淀较多，颜色亮白，效果较好。进一步通过定量分析及双向电泳图谱的比较分析表明，TCA/丙酮沉淀法在2-DE图谱上蛋白质点较多，分布均匀，图像清晰，而DTT/丙酮法相对于本实验中TCA/丙酮法检测到较少的蛋白质点外，2-DE图谱上有明显的纵条纹。因此TCA/丙酮沉淀法为提取油菜种子中蛋白质的最优方法。

油菜；蛋白质；提取方法；双向电泳

利用各种预分离技术降低样品体系复杂性，分离富集蛋白质并与现有的分离技术相结合，大幅度提高了蛋白质的检测率［1，2］。目前常用的提取蛋白质的方法有：（1）PEG沉淀法，能够简单、快速地富集蛋白质的预分离方法；（2）TCA丙酮沉淀法［3］，具有降低次生代谢物质的干扰、减少蛋白质降解等优点；（3）酚法［4］，利用Tris-饱和酚的特性。酚是蛋白质的良好溶剂，在样品制备过程中，蛋白质和脂类溶于酚相，盐、核酸、多酚和多糖等可溶性物质进入水相；（4）Tris-HCl法［5］，该方法在膜蛋白质和疏水性蛋白质的提取方面有所改善。用含SDS的Tris -HCl与TCA丙酮联合使用提取蛋白质，用80%的丙酮洗涤以除去水溶性杂质（包括高浓度的盐离子），比TCA丙酮法利用高速离心与丙酮洗涤的方法能更有效地排除杂质，也比传统的脱盐和透析方法要省时省力。此外，还有二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法［6］、酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法［7］、Mg/NP-40提取法［5］、Mg/NP-40/PEG4000/TCA/丙酮提取法［8］、试剂盒提取法等。随着双向电泳的发展，结合双向凝胶电泳的预分离技术已成为蛋白质组学中分析蛋白质的有力工具。

油菜是我国第一大油料作物，研究其脂肪酸合成机理是目前油菜分子生物学研究的热点和重点之一。目前，蛋白质组学研究备受关注，细胞或组织中受体分子、信号分子等参与基因表达调控即基因调控［9］均需要蛋白质的参与。授粉后20～35 d为油菜种子脂肪酸形成关键期［10］，本试验以此时期的种子为材料，对各种提取方法进行研究，以期找到适合双向电泳的蛋白质提取方法。

1 材料与方法

1.1供试材料

湘油15号授粉后20～40 d油菜种子。

1.2试剂

1.2.1 酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法试剂

TCA/丙酮溶液（含10%（W/V）三氯乙酸，0.07%DTT），0.1 M醋酸铵的甲醇溶液。

1.2.2 改良Tris-HCl法试剂

蛋白质提取液（50 mM Tris-HCl，pH 8.5，100 mM KCl，0.07%（W/V）DTT，30%甘油），80%丙酮，蛋白质提取缓冲液（0.1M Tris-HCl，pH 6.8，0.5% SDS，10%甘油，0.07%DTT），10%TCA/丙酮，80%冷丙酮。

1.2.3 TCA丙酮沉淀法试剂

样品提取液A：10%TCA，0.07%DTT，1 mM PMSF的丙酮溶液，-20℃保存；样品提取液B：0.07%DTT，1 mM PMSF 100%的丙酮溶液，-20℃保存。

1.2.4 二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法试剂

抽提裂解液（pH 8.0）：Lysis Buffer0.1M Tris-HCl（12.44 g）；1.4 M NaCl（81.816 g）；0.02 M Na2EDTA（7.45 g）；2%CTAB（20 g）；0.1%DIECA（1 g）；2%PVP K-30（20 g）加0.2%β-巯基乙醇后调pH值至8.0；碘代乙酰胺2-碘乙酰胺（IAM）。

1.2.5 双向电泳试剂

（1）琼脂糖封胶液配制：低熔点琼脂糖0.5 g， Tirs 0.303 g，甘氨酸1.44 g，SDS 1 mL（10%SDS），溴酚蓝100μL（1%溴酚蓝），ddH2O定容到100 mL。

（2）裂解液：7.0 M尿素，2.0 M硫尿，4% CHAPS，30 mM Tris-HCl，pH 9.0（Bio-Rad）。

（3）水化液：2.0 M硫脲，7.0 M尿素，2% CHAPS（不含DTT，不含Bio-Lyte）（Bio-Rad）。

（4）平衡母液：6 M尿素，50 mM Tris-HCl，20%甘油，2%SDS（Bio-Rad）。

（5）10×电泳缓冲液：250 mM Tris，1.92 M glycine，1%SDS，pH 8.3（Bio-Rad）。

（6）30%丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=29∶1（Bio -Rad）。

1.3蛋白质提取

1.3.1 改良Tris-HCl法

对谷瑞升［11］等人方法进行部分修改。操作步骤为，取1 g油菜种子液氮研磨，准确称取0.5 g粉末至10 mL离心管中，加入PVPP 0.3 g和蛋白质提取缓冲液4.5 m L（0.1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，0.5%SDS，10%甘油，0.07%（W/V）DTT），样品混匀后置4℃震荡浸提1 h，以充分溶解蛋白质，之后12 000 g 4℃离心20 min，吸取上清800μL，加入8 mL-20℃10%TCA/丙酮，混匀后置-20℃沉降蛋白质3 h，10 000 g 4℃离心30 min，弃上清，加入冷丙酮5 m L，涡旋，于-20℃下放置30 min，于10 000 g离心30 min，重复3次；加入冷的80%丙酮，涡旋，于-20℃下放置30 min，于10 000 g下离心30 min，重复1次；于室温下风干10～15 min使丙酮完全挥发，置于-80℃下保存。

1.3.2 TCA丙酮沉淀法

对Damerval C等人［3］的方法进行部分修改。取1 g，-80℃保存的油菜种子置于研钵中，迅速加入液氮，再加入少量的PVPP粉，研磨至细粉状，温度始终低于4℃。加入预冷保存的10倍体积的样品提取液A，于-20℃沉淀过夜；第二天4℃、15 000 r/min，离心30 min，弃上清，再加入预冷保存的10倍体积的样品提取液B，混匀，沉淀1～2 h，4℃、15 000 r/min，离心30 min，弃上清，重复此步4次，直到粉末变成白色。最后4℃离心30 min，弃上清，沉淀制成干粉，-80℃保存备用。

1.3.3 酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法

对范龙泉等［7］方法稍加修改，分别用Triton-X100和甘油替换原缓冲液中的SDS和蔗糖。称1 g种子研磨成粉，转至15 mL离心管，加入10倍体积-20℃预冷TCA/丙酮溶液。-20℃沉淀30 min后离心，弃上清；沉淀分别用0.1M醋酸铵甲醇溶液和冷丙酮清洗各1次，离心后沉淀室温干燥。按100 mg干粉加入0.5～0.8 mL提取液和等体积的Tris饱和酚（pH＞7.5），4℃下放置30 min；4℃，10 000 g离心15 min分相。将酚相转至另一干净离心管，加入5倍体积预冷的含0.1 M醋酸铵的甲醇溶液，涡旋30 s，-20℃沉降过夜。离心，弃上清；沉淀分别用0.1 M醋酸铵甲醇溶液、冷丙酮和80%冷丙酮清洗各1次。离心，沉淀冷冻干燥后，于-80℃保存备用。

1.3.4 二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法

对曾广娟等［6］方法稍加修改。取1 g种子，在液氮低温条件下研磨成粉末状，转进50 mL离心管；加入适量Lysis Buffer 3，加入终浓度1 mM PMSF、2 mM EDTA混匀，冰上放置5 min后加入终浓度10 mM DTT，冰浴超声5 min（2 sec/3 sec）；4℃条件下18 000 g离心15 min，取上清；往上清中加入5倍体积的10%TCA冷丙酮，加入终浓度10 mM DTT，混匀，-20℃沉淀蛋白质液过夜；4℃条件下12 000 g离心25 min，弃上清；往沉淀中加入适量冷丙酮、终浓度为10 mM DTT，捣碎沉淀，-20℃沉淀30 min，4℃条件下30 000 g离心15 min，弃上清；重复上一步骤3次，至上清澄清；风干沉淀中残余丙酮后，加入适量Lysis Buffer 3，加入终浓度10 mM DTT，冰浴超声5 min（2 sec/3 sec）；4℃条件下30 000 g离心15 min，取上清；往上清中加入终浓度10 mM DTT，56℃水浴1 h；加入终浓度55 mM IAM，暗室放置45 min；加入5倍体积的冷丙酮，-20℃沉淀蛋白质液过夜；4℃条件下30 000 g离心15 min除上清；沉淀冷冻干燥后，于-80℃保存备用。

1.4双向电泳方法

1.4.1 蛋白质浓度测定

用Bradford法［12］测量出蛋白质浓度后，分装保存在-80℃冰箱。

1.4.2 等电聚焦

按照表1程序进行等电聚焦。

表1 等电聚焦程序

1.4.3 第二向SDS电泳

第二向SDS-PAGE采用分离胶浓度为12%。用低熔点琼脂糖封胶液（0.5%低熔点琼脂糖，25 mM Tris，198 mM甘氨酸，0.1%SDS，痕量溴酚兰）封闭。待封胶液凝固后，在酸性端加相对分子质量标准蛋白质，进行第二向垂直电泳。5 w/gel恒功率电泳，待溴酚蓝前沿进入分离胶后，再15 w/gel恒功率电泳，直到溴酚蓝前沿到达距玻璃板底部0.5～1 cm处，结束电泳，准备剥胶与染色。

1.4.4 染色

考马斯亮蓝染色ddH2O洗3次，每次15 min，12%TCA固定2 h后，ddH2O洗3次，每次15 min。20%甲醇，1.6%磷酸，8%硫酸铵和0.08%考马斯亮蓝G250染色16～24 h，ddH2O漂洗脱色。

1.4.5 图像分析

用PDQest8.0图像分析软件对扫描图像分析差异点。

2 结果与分析

2.1不同提取方法的比较

高油酸油菜授粉20 d后种子中含有大量的色素、酚等次生代谢物质，这些物质的存在会严重影响第一向的等电聚焦。为了获得高质量的2-DE蛋白质样品，本试验采用了4种不同的蛋白质提取方法，即TCA/丙酮沉淀法、二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法、改良的Tris-HCl法和酚-甲醇/醋酸铵沉淀法处理样品。4种提取方法获得的蛋白质产量有所差异（表1）。改良的Tris-HCl法提取的蛋白质沉淀虽然步骤简单、提取时间短、操作容易，但是沉淀颜色偏黄，而且里面离子含量过多，聚焦容易失败，不利于双向电泳。酚-甲醇/醋酸铵沉淀法所得蛋白质沉淀不多，颜色较白，但是步骤较繁琐、耗时相对较长，蛋白质损失较多。TCA/丙酮沉淀法和二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法所得蛋白质沉淀干重差不多，颜色相近，都容易溶于裂解液，蛋白质净产量都高，而且在步骤、操作性、提取时间上相差不大。综合考虑，二方法在现阶段提取蛋白质都为较合适的方法，且都优于改良的Tris-HCl法和酚-甲醇/醋酸铵沉淀法。寻找最优方法，需通过进一步定量分析比较。

表2 不同提取方法所得油菜种子蛋白质

2.2 TCA/丙酮沉淀法和二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法的对比

当Bradford工作液考马斯亮蓝G-250和蛋白质在酸性条件下结合时，在一定的范围内，蛋白质含量与595 nm的吸光度成正线性相关关系（图1）。

图1 定量的标准曲线

由SDS-PAGE图谱（图2）可见，TCA/丙酮沉淀法（B）与二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法（A）相比，蛋白质条带稍强，在14 kD和20 kD处条带较强。从定量信息（表3）和电泳图谱看，两个样品的蛋白质总量都是合格的，能继续后续实验。

表3 定量信息

注：样品A表示用二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法得到的，样品B表示用TCA/丙酮沉淀法得到的。

图2 两种蛋白质提取方法的SDS-PAGE图谱比较

2.3两种蛋白质提取方法效果比较

二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法和TCA/丙酮沉淀法提取的油菜种子蛋白质得到的2-DE图谱如图3所示。在相同双向电泳条件下，用TCA/丙酮沉淀法制备的蛋白质样品（图3-a）的双向电泳结果优于二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法（图3-b），主要是得到的蛋白质点聚合较好，凝胶背景比较清晰，图谱质量好且纵横纹较少，可能是二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法提取的样品中蛋白质有所降解。经PDQest8.0图像分析软件对2种蛋白质提取方法得到的2-DE图谱进行分析，在TCA/丙酮沉淀法样品的2-DE图谱（图3-a）中分别检测到558个蛋白质点；而在二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法的2-DE图谱（图3-b）中分别检测到331个蛋白质点，明显比TCA/丙酮沉淀法少227个蛋白质点。而且TCA/丙酮沉淀法在操作方面也优于二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法。因此，对于油菜种子蛋白质提取方法的研究可以发现，TCA/丙酮沉淀法比较好。

图3 两种蛋白质提取方法的2-DE图谱比较

3 小结与讨论

3.1蛋白质提取方法比较

蛋白质的提取方法中最常用的是TCA/丙酮沉淀法，在提取过程中组分损失较少，具有广泛的适用性，在动植物组织［13］以及微生物材料中都能取得很不错的分离效果，而且在2-DE图谱上蛋白质点较多，分布均匀，适宜油菜种子中蛋白质的提取。改良Tris-HCl提取法除了分离到较多的中等分子量的蛋白质外，还得到了比例相当的高分子量和低分子量蛋白质。但是Tris碱虽可防止蛋白质的水解，却引入盐离子，会导致IEF（等电点聚焦）电压过低，从而影响聚焦。酚-甲醇/醋酸铵沉淀法分离得到的蛋白质点数的比例在碱性区域（p I 4～7）比Tris-HCl提取法得到的蛋白质点的比例高，但是总量相对较少。二硫苏糖醇（DTT）/丙酮法所得蛋白质沉淀多，纯度高，易溶于裂解液，且蛋白质净产量都高，但在本实验中比TCA/丙酮法检测到蛋白质点少，且2-DE图谱上有明显的纵条纹。

3.2蛋白质提取方法对双向电泳的影响

蛋白质样品的制备直接影响双向电泳的分辨率和重复性，特别是植物细胞有很厚的酚类、醌类等次生代谢物质，如果样品处理不当，这些物质会干扰第一向IEF，同时不恰当的蛋白质沉淀方法会导致一些膜蛋白质和疏水性蛋白质的丢失［14］。植物组织的蛋白质组成是动态的，至今没有一种通用的制备方法能将样品中的蛋白质全部提取出来。蛋白质制备方法虽然很多，但都尽可能多的提高样品蛋白质的溶解度，提取最大量的蛋白质，减少蛋白质损失；减少双向电泳干扰物（主要有盐类、脂类、多糖和核酸等），以免其破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用。

［1］ Espagne C，Martinez A，Valot B，et al.Alternative and effective proteomic analysis in Arabidopsis［J］.Proteomics，2007，7：3788-3799.

［2］ Widjaja I，Naumann K，Roth U，et al.Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low-abundance proteins differentially regulated during plant defense［J］.Proteomics，2009，9：138-147.

［3］ Damerval C，Vienne D，Zivy M，et al.Technical improvements in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling protein［J］.Electrophoresis，1986，7（1）：52-54.

［4］ Isaacson T，Damasceno CM，Saravanan RS，et al.Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissu［J］.Nature Protocol，2006，1：769-774.

［5］ 梁书剑，张 萌，王 巍，等.双向电泳比较两种方法获得的水稻叶片蛋白质［J］.生物学杂志，2009，26（3）：68-71.

［6］ 曾广娟，李春敏，张新忠，等.适于SDS-PAGE分析的苹果叶片蛋白质提取方法［J］.华北农学报，2009，24（2）：75-78.

［7］ 范龙泉，胡新明，赵进峰，等.甜瓜幼苗根系总蛋白质提取方法的筛选及其电泳条件的建立［J］.河北农业大学学报，2012，35（4）：33-36，50.

［8］ 钟 俐，马成梅，梁永增，等.甜瓜叶片中Rubisco的去除及双向电泳体系的优化［J］.植物生理学报，2012，48（3）：303-309.

［9］ Görg A，Weiss W，Dunn MJ.Current two-dimensional eletrophoresis technology for proteomics［J］.Proteomics，2004，4：3665-3685.

［10］Peng Qi，Hu Yan，Du Pei-Fen，et al.Construction of SSH library with different stages of seeds development in Brassica napus L.［J］.Acta Agronomica Sinica，2009，35（9）：1576-1583.

［11］谷瑞升，刘群录，陈雪梅，等.一种省时高效的木本植物蛋白质双向电泳分析方法［J］.北京林业大学学报，1999，21（5）：7-10.

［12］Bradford MM.A rapid method for the quantification ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72：248-254.

［13］Wang X，Chang L，Wang GC，et al.Protein extraction from the earthworm Eisenia fetidafor 2-DE［J］.Proteomics，2010，10（5）：1095-1099.

［14］罗泽宇，杨粤军，刘选明.拟南芥蛋白质组研究中双向电泳技术条件的优化［J］.激光生物学报，2008，17（4）：539-543.

Study on Protein Extraction Methods for Seeds of Rapeseed

YANG Liu，LIHai-lin，ZHANG Zhen-qian*
（College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

To screen optimal protein extraction method for immature seeds of rapeseed，four methods，the improved Tris-HClmethod，phenol extraction-methanol/ammonium acetate precipitation，TCA/acetone precipitation and DTT/acetone method，were compared.The results showed that the TCA/acetone precipitation method and DTT/acetonemethod could gainmore protein precipitation，more brightwhite color，and the effectwas better.Further quantitative analysis and twodimensional electrophoresis comparative analysis showed that TCA/acetone precipitation method could gain more protein points on 2-DEmap，and the distribution was uniform，the image was clear，while DTT/acetonemethod detected less protein points，and the 2-DE map had obvious vertical stripes.So TCA/acetone precipitationmethod was the optimal protein extractionmethod for seeds of rapeseed.

rapeseed；protein；extractionmethod；two-dimensional electrophoresis

Q51；S565.4

A

1001-5280（2015）01-0011-05 DOI：10.3969/j.issn.1001-5280.2015.01.04

2014 10- 28

杨 柳（1982-），女，湖南湘阴人，硕士，实验师，从事油菜育种研究，Email：yxtl914@sohu.com。*通信作者。

国家自然科学基金项目（31201240）；湖南农业大学青年基金（12QN27）。