血管生成素2在大鼠内毒性急性肺损伤中的作用与机制研究

钟明媚 宣国平 李 诗 王 璠 张 琳

·基础医学·

血管生成素2在大鼠内毒性急性肺损伤中的作用与机制研究

钟明媚 宣国平 李 诗 王 璠 张 琳

目的 探讨血管生成素-2(Ang-2)在脂多糖(LPS)致大鼠急性肺损伤(ALI)时的表达及其机制。方法 48只清洁级SD大鼠随机分为正常对照组、1 mg/kg LPS组、5 mg/kg LPS组和10 mg/kg LPS组，每组12只。LPS组尾静脉注射不同剂量LPS复制ALI模型，对照组注射同等体积生理盐水，留取肺组织标本，观察肺湿/干重(W/D)比值、HE染色光镜观察肺组织标本病理改变并进行肺损伤评分，各组ELISA法检测血浆中Ang-2与血管内皮生长因子(VEGF)的表达，Westernblot方法检测肺组织中Ang-2的蛋白表达情况。结果 LPS注射进入大鼠尾静脉6 h后，光镜下可见肺组织内的炎性细胞浸润，肺泡隔增宽，肺间质水肿和肺结构破坏等病理改变；LPS各组的肺损伤评分与W/D比值明显高于对照组(P<0.05)；LPS不同剂量组血浆中Ang-2与VEGF的表达水平较对照组明显增高(P<0.05)，血浆中Ang-2的表达与VEGF、肺损伤评分呈正相关(r=0.826,P<0.05;r=0.775,P<0.05);LPS不同剂量组与Ang-2蛋白的表达水平呈现剂量效应关系(P<0.05)。结论 Ang-2参与大鼠ALI的发病过程，且Ang-2水平增高与ALI严重程度有关。

血管生成素-2；急性肺损伤；脂多糖；血管内皮生长因子

脓毒症引起的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是临床常见危重症，其病理特征表现为弥漫性肺泡及微血管内皮细胞损伤、肺水肿及肺不张等[1,2]，临床上可表现为顽固性低氧血症及难治性急性呼吸衰竭[3]。尽管随着呼吸支持技术的不断进步，病死率已有所下降，但仍高达40%左右[4]。 因此，进一步阐明ALI/ARDS的发病机制，寻找新的，尤其针对其发病机制的防治措施，是目前临床急需解决的重要问题。

血管生成素(angiopoietin,Ang)是一组分泌型内皮细胞特异性生长因子，包括四个亚型：Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4。Ang-2主要由内皮细胞分泌，作用于内皮细胞含有免疫球蛋白和表皮生长因子同源结构域2的酪氨酸激酶(tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains 2,Tie-2)，其过表达可破坏血管形成，导致血管通透性增高，引起血管渗漏[5]。我们的临床研究发现ARDS患者血浆中Ang-2水平升高是内皮细胞损伤和血管通透性增加的重要标志，Ang-2在ARDS的发生与发展中起着重要的作用，且对其预后判断也具有重要的参考意义[6]。本研究旨在通过应用不同浓度大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所导致大鼠ALI模型，观察Ang-2表达水平的变化及Ang-2的水平与ALI程度的相关性，探讨Ang-2在ALI发生发展中的作用，为进一步阐明ALI的发病机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 健康清洁级成年雄性SD大鼠48只，体质量(200±20)g，由安徽医科大学动物实验中心提供。实验前，大鼠被饲养在恒温的环境中，自由饮水与进食。

LPS(E.coli O111：B4)购自美国Sigma 公司；Ang-2 和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)酶联免疫试剂盒购自上海鑫乐公司；Ang-2 抗体和内参βactin购于美国Abcam公司；手动玻璃匀浆机(宁波新芝科器研究所)；western blot电泳仪(164-5051型美国Bio-Rad公司)。

1.2 模型制备及分组 实验大鼠随机分为4组，分别为正常对照组(n=12)，1 mg/kg LPS组(n=12)，5 mg/kg LPS组(n=12)，10 mg/kg LPS组(n=12)。参照课题组先前研究[7]，采用尾静脉注射LPS制作内毒素性ALI模型(不同剂量LPS生理盐水稀释至1 mL后进行注射)，正常对照组大鼠尾静脉注射1 mL生理盐水。

1.3 肺水含量检测 通过计算肺组织的湿/干重(wet/dry，W/D)比值来反应肺组织的含水量。大鼠放血处死后，打开胸腔，左肺尽量放出肺血管内残血，并用滤纸吸干表面的渗液和血迹，左肺组织称量湿重；置真空干燥箱，80℃脱水72 h，至重量不再变化，烤干后的肺组织称量干重。肺W/D比值表示肺组织含水量。

1.4 肺组织病理学检查 取各实验组大鼠，开胸后取右肺中叶，以4%多聚甲醛固定，酒精干燥，石蜡包埋，切成6 μm厚度的切片，经苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肺组织的病理学变化。

将肺组织病理切片放置于光学显微镜下观察，肺损伤评分遵循以下标准[8]：肺泡内充血；红细胞渗出；肺泡腔内中性粒细胞渗出或集聚；肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4项指标，分别按照病变的严重程度评分0～4分(0:无病变或非常轻微;1:轻度;2:中度;3: 重度;4:极重度)。各项评定的分数之和则是ALI的肺损伤评分。

1.5 western blot检测肺组织中Ang-2蛋白的表达 取右肺中叶，冻存于液氮中，以备日后匀浆。取肺组织100 mg放入匀浆器中，同时加入组织裂解液1 mL充分裂解15 min。4℃，12 000 r，离心15 min，留取上清液。然后进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，孵育一抗(Ang-2抗体，1 ∶1 000)4℃过夜。TBST漂洗后，与二抗HRP(辣根过氧化物酶标记抗体1 ∶5 000)结合，室温下在摇床上孵育1 h。TBST再次漂洗后将显影液加于PVDF膜上，暗室中显影。

1.6 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中Ang-2与VEGF的表达 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血浆中Ang-2与VEGF的的浓度。检测步骤按照试剂盒说明书操作。如果样本浓度超过了标准曲线的极值，将样本稀释后重新检测。

2 结果

2.1 肺组织病理形态学变化 取注射LPS后6 h的大鼠肺组织病理切片,光镜下观察。正常对照组：肺泡结构清晰，肺泡隔未见增宽，肺泡壁薄，肺泡腔内未见出血及炎细胞渗出，见图1。1 mg/kg LPS组：大鼠肺泡腔可见少量渗出和出血，肺泡隔轻度增厚，少量炎性细胞浸润，见图2。5 mg/kg LPS组：大鼠肺泡腔中可见中等量红细胞渗出及炎性细胞浸润，见图3。10 mg/kg LPS组，肺内多量炎细胞浸润，伴肺泡间隔明显增厚，肺泡内大量红细胞渗出以及肺间质水肿，肺组织原有形态结构严重破坏,见图4。

2.2 肺组织W/D比值测定与肺损伤评分 正常对照组肺W/D比值为5.19±0.98，不同剂量LPS组大鼠W/D比值较正常对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，并且随着LPS浓度的增高，W/D比值也随之升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。遵循肺损伤评分标准进行肺组织病理肺损伤评分，不同剂量LPS组肺损伤评分较正常对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，并且随LPS剂量的增加其肺损伤评分越高，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1 对照组肺组织病理学变化(HE×400) 图2 1 mg/kg LPS组肺组织病理学变化(HE×400)

图3 5 mg/kg LPS组肺组织病理学变化(HE×400) 图4 10 mg/kgLPS组肺组织病理学变化(HE×400)

表1 各组大鼠肺组织 W/D比值与肺损伤评分

注：与对照组比较,aP<0.05；与1 mg/kg LPS组比较,bP<0.05；与5 mg/kg LPS组比较,cP<0.05

2.3 血浆Ang-2与VEGF水平的变化 不同剂量LPS组血浆中Ang-2以及VEGF水平较正常对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，并且随LPS剂量增加其表达水平升高，各组间差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血浆Ang-2与VEGF的变化

注：与对照组比较,aP<0.05；与1 mg/kg LPS组比较,bP<0.05；与5 mg/kg LPS组比较,cP<0.05

2.4 ALI大鼠Ang-2水平与VEGF、肺损伤评分的相关性 ALI大鼠血浆中Ang-2水平与VEGF、肺损伤评分均呈明显的正相关性(r=0.826,P<0.05；r=0.775,P<0.05)，见图5。

图5 血清中Ang-2水平与VEGF(A)、肺损伤评分(B)相关性分析

2.5 western blot检测肺组织中Ang-2的蛋白表达水平 提取肺组织中的蛋白，经SDS-PAGE电泳分离蛋白后，分别以β-actin和Ang-2抗体进行western blot分析，见图6、表3。正常对照组大鼠肺组织存在微量的Ang-2蛋白表达，不同剂量LPS组肺组织Ang-2蛋白表达水平显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着LPS剂量的增加其Ang-2蛋白表达丰度越高，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

内毒素性ALI是临床常见危重症，由肺内炎症效应细胞(如中性粒细胞、单核巨噬细胞)介导肺微血管通透性增高、肺水肿是ALI的病理基础[9]。由于ALI的发生有其自身特点，单纯抑制生长因子(VEGF)或炎症因子(白细胞介素等)并不能根本缓解ALI的呼吸功能损失，抑制血管渗漏将会成为ALI未来研究的重点[10,11]。

表3 各组肺组织中Ang-2蛋白表达相对灰度值

注：与对照组比较，aP<0.05；与1 mg/kg LPS组比较,bP<0.05；与5 mg/kg LPS组比较,cP<0.05

Ang及其相关受体Tie-2参与ALI的发病过程，Ang-2主要是由内皮细胞分泌而成，其过度表达可破坏血管生成，Ang-2与内皮细胞特异性受体Tie-2相结合，可导致血管通透性增高，引起血管渗漏。Ang-2是脓毒症相关肺损伤时内皮屏障破坏的重要介质[12-14]，严重脓毒症血循环Ang-2明显增高，过度增高的Ang-2对肺高通透性具有重要病理作用，且Ang-2与疾病的严重程度以及ALI患者的死亡率增加密切相关[15,16]。

本研究在LPS尾静脉注射成功制作的大鼠内毒素ALI模型的基础之上，应用不同剂量的LPS(1、5、10 mg/kg)通过尾静脉注射进入大鼠体内，结果表明，随着LPS剂量的增加，大鼠ALI的程度越发加重，LPS组大鼠血浆中Ang-2比对照组显著升高，并且随着肺损伤程度的加重，Ang-2的表达水平也随之升高，从而说明Ang-2参与了ALI的病理过程，且Ang-2含量升高可能是ALI严重程度的危险因素，血中Ang-2水平对ALI病情评价和预后具有重要价值。

VEGF是一种生长因子，又是一种通透因子，具有能够促进肺微血管内皮细胞分裂增殖、诱导新生血管形成以及增加血管壁通透性的作用[17]，因此肺损伤时VEGF可表现出明显的异常。本研究结果表明，不同剂量LPS组血浆中VEGF水平较正常对照组显著升高，且肺损伤大鼠血浆中Ang-2水平与VEGF呈明显的正相关性。Benest等[18]研究表明Ang-2-/-基因敲除小鼠可明显减少VEGF、缓激肽、组胺等引起的血管渗漏，并提出Ang-2是多血管通透性诱导因子的关键以及核心因子。本研究结果亦提示Ang-2在ARDS血管渗漏中发挥着重要作用。

综上所述，内毒素性大鼠ALI时肺组织Ang-2表达明显增高，且与血清中VEGF、肺组织损伤评分密切相关，提示Ang-2导致脓毒症大鼠肺组织通透性增加，从而可能最终导致肺组织的一系列病理生理的改变。因此Ang-2的研究为临床防治ALI提供了新的治疗靶点，对Ang-2导致肺毛细血管渗漏的确切机制值得进一步深入研究。

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(2015-05-08 收稿 2015-06-12 修回)

Effect of angiopoietin-2 on LPS-induced rat acute lung injury

ZhongMingmei,XuanGuoping,LiShi,etal

IntensiveCareUnit,theFirstpeople'sHospitalofHefei(theThirdAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity),Hefei230061,China

Objective To explore the expression and the potential effect of angiopoietin-2(Ang-2) in rats with acute lung injury(ALI). Methods Forty-eight male Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into four groups(n=12), which were normal control group, 1 mg/kg lipopolysaccharide (LPS) group, 5 mg/kg LPS group and 10 mg/kg LPS group. The ALI models were produced through venous injection of different doses of LPS, and the control group was injected with the same dose of saline. Lung samples were observed, lung wet and dry weight ratio (W/D), lung histopathology, and pathological score were detected. Plasma Ang-2 and vascular endothelial growth factor(VEGF) were assessed by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Protein was extracted from lung tissues for determination of Ang2 by Western blot analysis. Results After 6 h of LPS injected into the tail vein of the rats, the inflammatory cell infiltration, alveolar septum widened, the changes of pulmonary interstitial edema and pulmonary pathological damage were seen in lung tissues under the light microscope. The pathological score and W/D in LPS group were significantly higher than those in control group (P<0.05). The plasma levels of Ang-2 and VEGF were significantly increased compared with control group (P<0.05), and the plasma levels of Ang-2 were significantly positive correlated with VEGF levels (r=0.826,P<0.05) and pathological score (r=0.775,P<0.05). The expression of Ang-2 protein in different doses of LPS group was dose-dependent (P<0.05). Conclusion Ang-2 is involved in the pathogenesis of acute lung injury in rats, and the level of Ang-2 is positively correlated with the severity of acute lung injury.

Angiopoietin-2;Acute lung injury;Lipopolysaccharide;Vascular endothelial growth factor

安徽省自然科学基金(项目编号：1208085QH142)

230061 安徽省合肥市第一人民医院(安徽医科大学第三附属医院)重症医学科(钟明媚,宣国平,李诗,张琳),医务部(王璠)

张琳，2005202zhl@sina.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.09.001