怀有先天性心脏病胎儿的孕妇与正常孕妇肠道菌群的高通量测序分析

宋勇战， 钱明阳， 李渝芬， 钟诗龙， 刘宝龙， 欧艳秋， 张智伟△， 曾国洪△

(1广东省心血管病研究所， 2广东省人民医院，广东省医学科学院，广东 广州 510100； 3南方医科大学研究生学院，广东 广州 510515)



怀有先天性心脏病胎儿的孕妇与正常孕妇肠道菌群的高通量测序分析

宋勇战1， 钱明阳1， 李渝芬1， 钟诗龙2， 刘宝龙3， 欧艳秋1， 张智伟1△， 曾国洪1△

(1广东省心血管病研究所，2广东省人民医院，广东省医学科学院，广东 广州 510100；3南方医科大学研究生学院，广东 广州 510515)

目的： 分析怀有先天性心脏病胎儿的孕妇(PW组)与正常孕妇(NW组)的肠道菌群特征。方法: 对可能引起个体肠道菌群差异的因素加以控制，2013年6月18号～2013年12月17号收集15例正常孕妇和17例异常孕妇的粪便样本，提取细菌基因组DNA，用PCR方法扩增16S rDNA，进行二代Illumina测序。测序数据应用运算分类单位(operational taxonomic unit，OTU)聚类分析、多样性分析和分类学分析等生物信息技术分析2类孕妇肠道菌群的结构、多样性和丰度。结果: 2类孕妇肠道菌群的高通量测序分析分别得到2 696 276(NW组)条和2 445 530(PW组)条优化序列，测序覆盖深度>97%。经过97%相似度归并后分别得到77 243个(NW组)和75 600个OTUs(PW组)；菌群多样性分析显示正常孕妇肠道菌群的Chao 1指数和Shannon指数均高于异常孕妇。在最佳分类水平上，正常孕妇肠道菌群由38个科的细菌构成，归属于14个门，以厚壁菌门(Firmicutes)为主，其次为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)等。怀有先心胎儿孕妇肠道菌群构成与正常孕妇相似，最佳分类水平上由33个科的细菌构成，归属于9个门，其中Firmicutes为(75.7±15.8)%，Proteobacteria为(21.1±17.0)%，Actinobacteria为(2.0±2.1)%。在最佳分类水平上，方差分析显示两者的双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)和红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)菌种丰度有明显差异。结论: PW组孕妇与NW组孕妇相比，整体肠道菌群含量明显下降，提示PW组孕妇有更恶劣的肠道环境，其中部分菌群含量存在明显差异。先天性心脏病胎儿的发生可能与孕妇恶劣的肠道微环境有关，其中Bifidobacteriaceae和Coriobacteriaceae在先天性心脏病的预防方面可能有重要作用。

肠道菌群； Illumina测序； 双歧杆菌科； 红蝽杆菌科； 先天性心脏病

肠道菌群被誉为是人体自身的黑匣子，一切的生命活动和代谢情况，都可以从中窥见一斑[1]。已证实肠道菌群与人体过敏反应、自身免疫病、肥胖、糖尿病、心血管疾病、自闭症和神经系统疾病等都有明确的关系[2]。考虑到一切的外在因素最终都要通过母体影响胎儿的发育，被誉为人体另一器官、可导致机体各个系统发病的肠道菌群，可能是其中一条途径。借助宏基因组学相关技术[3]，我们对15例正常孕妇与17例怀有先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)胎儿孕妇的肠道菌群进行高通量测序和生物信息学分析，探讨其结构组成、菌群多样性和丰度等各方面差异，旨在为先天性心脏病的早期预防、诊断和治疗探索新的路径。

材 料 和 方 法

1 样本的收集

2013年6月18日～2013年12月17日在广东省人民医院心儿科收集17例怀有先天性心脏病胎儿孕妇的粪便标本命名为PW组；在广东省人民医院妇产科收集15例怀有正常胎儿孕妇的粪便标本(在我院妇产科产检未发现异常)命名为NW组。2组孕妇的基本情况见表1，孕前体重、身高和年龄经两独立样本t检验，均没有明显差别(P>0.05)。所有入选孕妇要求近3个月之内未使用过抗生素。样本质量≥5 g，放入无菌 EP 管中，做好标记，-80 ℃冰箱冻存待用。采集和运送样本过程严格按照无菌操作规程进行。同时，参阅相关文献[4]，对可能引起菌群差异的其他相关因素进行登记。怀有先天性心脏病胎儿孕妇的临床诊断：所选标本均为有明显畸形，胎儿多为复杂先心，见图1；单纯病变仅限大室间隔缺损(缺损>5 mm)；小房间隔缺损、小动脉导管未闭、小室间隔缺损均排除，确保在诊断方面没有问题(17例胎儿中，大室间隔缺损3例，复杂先心病14例)。怀有正常胎儿孕妇的临床诊断为在广东省人民医院妇产科产检过程中未发现任何异常的病例。

表1 2组研究对象的一般资料

Figure 1.B-ultrasonography mode showing that the heart presences a huge atrial septal defect and a huge ventricular septal defect (A) and color Doppler ultrasound showing that the blood circulates randomly inside the heart (B).

图1 二维切面及彩色多普勒切面显示的胎儿复杂性先心病

2 肠道细菌宏基因组 DNA 的提取

使用细菌基因组提取试剂盒(Tiangen)制备细菌DNA，按试剂盒说明书操作。

3 16s rDNA V4可变区的扩增

所提取的DNA经过NanoDrop分光光度计检测，所有样品A260/A280比值均在 1.8～2.0之间。对合格的DNA样品采用细菌16S rDNA的V4区通用引物(520F：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACA-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACGATGC-TAYTGGGYDTAAAGNG-3’；5’-803R：CAAGCAGAA-GACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAG-ACGTGTGCTCTTCCGATCTCTACCRGGGTATCTAATC-C-3’)进行PCR扩增，扩增片段长度为 283 bp左右，引物交由广州基迪奥生物科技有限公司合成。PCR反应体系为25 μL。

4 16S rDNA 宏基因组测序

PCR产物定量均一化后由基迪奥生物科技有限公司进行高通量测序。本次 32 个样品，16S rDNA高变区测序所采用的测序策略为 Illumina系统的MiSeq平台， PE250测序，V4 区域。

5 生物信息学分析

主要包括 (1) 数据过滤及拼接；(2) tags物种注释；(3)运算分类单位(operational taxonomic unit, OTU)与物种注释；(4) 样品的复杂度分析；(5) 多样品比较分析等。

6 统计学处理

应用SPSS 13.0软件，对年龄、身高、体重、OTU数量、分类种数计量资料进行两独立样本t检验, 使用R语言对2组(正常与先心病)样本的菌种丰度进行方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

从短期形势来看，在次贷危机过后，美国的经济出现复苏乏力的态势，存在失业率较高的问题，同时欧盟、日本以及中国、印度等新兴国家也逐渐加大对科技创新的战略部署，因此美国政府通过创新战略进一步强调科技创新的重要性，开启全民创新，提供高质量就业岗位，以创新作为突破口缓解美国当时的内忧和外患[7]。

结 果

1 测序质量评价

从怀有正常胎儿的孕妇样品中，我们共获得2 696 276优化序列条，经过97% 相似度归并后得到77 243 个OTUs；从怀有先天性心脏病胎儿的孕妇样品中，我们共获得2 445 530条优化序列。经过97% 相似度归并后得到75 600个OTUs，测序覆盖深度大于0.97。绘制稀释曲线(rarefaction curve)，大部分测序样品未进入平台期，显示随着测序量的增加仍会有新的种系被发现，见图2。

2 菌群多样性分析

2类孕妇肠道菌群的多样性指数如表2所示。2类样本chao 1值和ACE值差别较大。NW组的chao 1平均值为(24 545.29±8 615.56)， ACE值为(56 171.10±28 316.01)，而PW组的 chao 1平均值为(15 707.10±4 066.74)和ACE值为(32 540.04±8 760.90)，显示NW组孕妇肠道菌种丰度要高于PW组孕妇。

Figure 2.The rarefaction of different samples (97% similarity).

图2 各样品在97%相似度的稀释曲线图

Shannon、npShannon和Simpson这3个指数显示两组病人之间在菌群多样性方面差异较小。Shannon曲线图显示所有样本已进入平台期，随测序深度增加样品多样性不会有明显变化，见图3。

3 物种分析

克隆序列经过剪接加工整理，与16S rDNA数据库(Ribosomal Database Project, RDP)比对，鉴定微生物菌种。基于菌门(phylum)级别分类及最佳分类水平菌科(family)级别分类，计算各样品丰度。统计分析比较2组间菌种分布差异。

表 2 2组孕妇肠道菌群的多样性指数

Table 2.The diversity indexes of the intestinal microbial flora from the pregnant women in the 2 groups

DiversityindexNWPWChao124545.29±8615.5615707.10±4066.74ACE56171.10±28316.0132540.04±8760.90Shannon3.91±0.523.54±0.64npShannon4.03±0.533.65±0.66Simpson0.06±0.030.10±0.07

讨 论

先天性心脏病是指出生时即存在的心脏、血管结构和功能上的异常。是由于各种原因引起的正常心脏、血管组织胚胎发育异常，或是胚胎早期停止发育引起。据统计，出生缺陷已逐渐成为我国围生期儿死亡的主要原因，而先心病占据了主要出生缺陷疾病的1/3，是最常见的心脏病。最新调查统计表明，存活新生儿中先天性心脏病的发病率为0.6%～1.0%， 国内最近调查北京市所有出生于 2007年间的新生儿，发现先天性心脏病的发病率为 0.82%，其中死产和活产婴儿的发病率分别为 16.88%和0.67%[5]。虽然先天性心脏病的患病人数并不少，有关先天性心脏病病因的研究也有很多，但目前并没有突破性的进展。病因方面取得共识的主要有遗传因素、环境因素及母体方面的因素。

Figure 3.The Shannon-Wiener curves.

图3 Shannon指数图

Figure 4.The main components of the gut microbiota in the 2 groups.

图4 2组孕妇肠道菌群主要成分图

既往对先天性心脏病病因的研究，各个中心、各个地区结论不一[6-9]，且很多为环境污染等不可控因素，但各种外在因素最终是如何引起胎儿发育畸形的并没有相关研究。鉴于肠道菌群对人体各个系统的广泛作用，我们筛选了2组孕妇对肠道菌群与先心病的关系做一初探。

本次研究通过对17例异常孕妇和15例正常孕妇进行第2代高通量测序，共获得2 696 276条优化序列，分别得到75 600和77 243个OTUs，两样本的coverage 指数均在0.97 以上，测序深度合理。菌群多样性分析显示NW组的chaol值、ACE均明显高于PW组，显示正常孕妇肠道菌群各菌种丰度要高于怀有先心胎儿的孕妇，怀有先心胎儿的孕妇整体肠道菌群含量下降，有更为恶劣的肠道微环境。2组孕妇的Shannon、npShannon及Simpson指数差别不大，显示两者在菌群多样性方面差异较小。

菌群组成方面,通过与标准数据库进行比对，门水平上，2组孕妇均以厚壁菌门、变形菌门、放线菌门组成为主，占比达到98%以上，与以往报道正常人肠道菌群组成相似[10]。显示人体肠道菌群有很好的稳定性，怀孕并没有引起肠道菌群的剧烈变化。最佳分类水平上，经多元方差分析发现，2组孕妇大部分菌科均无明显差别，为人体肠道正常菌群，主要组成菌群也类似。但在双歧杆菌科、红蝽杆菌科两者含量存在明显差别，双歧杆菌科在NW组孕妇的丰度平均值为6.91%，在PW孕妇的平均值为1.48%；红蝽杆菌科在NW组孕妇的丰度平均值为4.76%，在PW组孕妇的丰度平均值为0.33%。NW组孕妇两科细菌的含量要显著高于PW组孕妇。

课题设计之初我们就考虑到个体因素可能对实验结果的影响，借鉴既往研究的经验[4, 11-12]，我们尽量排除了一些混杂因素可能带来的影响。病例选择方面，怀孕之后绝大多数妈妈都会很注意自己的饮食起居，基本上也不会使用任何药物。我们此次筛查的病例都为南方人，来自广东、福建、湖南 3 省的常住人口，以广东居多，饮食习惯较为类似；家庭收入方面，绝大部分家庭人均月收入在0.5万～1.2万之间，考虑到孕妇在家庭中的优先权，经济原因导致的区别基本可以排除；极个别孕妇对饮食有特殊嗜好，由于担心对胎儿的影响，也会有所节制；入选所有孕妇均没有不良嗜好，不抽烟、不喝酒，没有药物滥用史，家族没有先心病遗传病史，没有高血压、糖尿病、乙肝等常见病，均为汉族，学历以本科、大专居多，占比达到80%。考虑到怀孕后孕妇基本以居家修养为主，孕妇的职业、户口类型不作为影响因素。入选病例基本可以代表中国南方一名普通孕妇日常的生活状况。基于此，基本可以认为双歧杆菌科和红蝽杆菌科在2组孕妇中的差别为绝对差别。

由此我们得出的结论，怀有先心胎儿的的孕妇似乎有更恶劣的肠道微环境，整体菌群的丰度较正常孕妇有所下降。对于两者存在明显差异的两类细菌，搜索文章发现双歧杆菌科、红蝽杆菌科均为肠道益生菌，参与人体的营养代谢、免疫调节、自身保护等各个环节[13]。尤其是双歧杆菌，它的含量和种类的变化是肠道菌群稳定与否的风向标[14]。其终生定植于人类肠道中且数量最占优势，决定着我们的身体健康甚至寿命的长短。目前已认识到与机体的免疫功能、衰老、肿瘤甚至一些慢性病，如冠心病等密切相关。但是对双歧杆菌的研究滞后，认识不足，也是目前学界的共识。至于孕妇肠道双歧杆菌的变化对胎儿发育的影响，笔者搜索文章更是没有报道。不过益生菌的显著减少，可能就意味着无关菌群或者恶性菌群的增加，势必会影响到孕妇很多的代谢过程，至于具体到对胎儿发育的影响，还有待后续的研究。

目前该结论的适用有一定的局限性，因为2组孕妇平均的确诊时间都在28～29周左右，基本都在孕后期。一方面这是由于胎儿心血管系统发育成熟的时间所限，基本要在孕22周以后我们才能得到清晰可靠的超声图像；另一方面，对每一个怀疑有先心病的胎儿，我们至少要复查2次甚至多次才会确诊。究竟在孕早期甚至怀孕之前是不是两者已经有肠道菌群的差异，是不是正是由于肠道菌群的普遍减少，才会引起先心胎儿的出现，又是什么原因引起2组孕妇肠道菌群的变化，通过补充益生菌能不能预防先心胎儿的出现这些问题的解答都有待于后续的研究，但可以肯定的是我们为先心病的预防、诊断甚至治疗探索到了一条新的路子。

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Transcriptome characterization of intestinal microbial flora in different pregnant women using Illumina sequencing

SONG Yong-zhan1, QIAN Ming-yang1, LI Yu-fen1, ZHONG Shi-long2, LIU Bao-long3, OU Yan-qiu1, ZHANG Zhi-wei1, ZENG Guo-hong1

(1GuangdongCardiovascularInstitute，2GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalScience,Guangzhou510100,China;3GraduateSchoolofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:yong.zhan2008@163.com;drzhangzw@sohu.com)

AIM: To investigate the characteristics of the intestinal microbial flora in the pregnant women with congenital heart disease fetus (PW group) and normal pregnant women (NW group). METHODS: Stool samples were collected from 15 NW and 17 PW cases. The bacterial genomic DNA was extracted. The 16S rDNA was amplified by PCR, and the second generation of Illumina sequencing was conducted. RESULTS: We obtained 2 696 276 (NW group) and 2 445 530 (PW group) optimized sequences. The coverage was greater than 97%. We obtained 77 243 operational taxono-mic units (OTUs) in NW group and 75 600 OTUs in PW group after a 97% similarity merge. In NW group, the Chao 1 index and the Shannon index were greater than those in PW group. The diversity analysis of microbial population indicated that they were mainly composed ofFirmicutes,ProteobacteriaandActinobacteria. In family, theBifidobacteriaceaeandCoriobacteriaceaewere significantly different through analysis of variance. CONCLUSION: TheBifidobacteriaceaeandCoriobacteriaceaemay play an important role in the occurrence of congenital heart disease.

Intestinal microbial flora; Illumina sequencing;Bifidobacteriaceae;Coriobacteriaceae; Congenital heart disease

1000- 4718(2015)04- 0702- 05

2014- 11- 10

2015- 01- 21

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.023

△通讯作者 曾国洪 Tel: 020-83827812-10810; E-mail: yong.zhan2008@163.com; 张智伟 Tel: 020-83827812-10810; E-mail: drzhangzw@sohu.com