阳离子聚合物介导的基因治疗细胞内途径和主要屏障研究进展

Progress research on intracellular pathway and main barriers of cationic polymer－mediated gene therapy

［文献标志码］A

［文章编号］1671－587Ⅹ（2015）01－0199－04

DOI：10.13481／j.1671－587x.20150139

［收稿日期］2014－03－29

［基金项目］国家自然科学基金资助课题（51201110）

［作者简介］王茹燕（1987－），女，宁夏回族自治区银川市人，医学硕士，主要从事阳离子聚合物介导的基因治疗方面的研究。

［通信作者］彭　琳，副教授，硕士研究生导师（Tel：028－85503571，E－mail：gaoendo＠163.com）

选择合适的基因传递载体，使目的基因靶向、可控并有效地表达，是基因治疗成功的关键。非病毒载体具有合成简单、可以携带大容量的遗传物质和无免疫原性等优点而愈来愈受到研究者的重视 ［1－2］。其中阳离子聚合物由于具有安全性高，免疫原性低，易于对DNA进行操作，价格低，特别是其结构易于改造等优点，已经被广泛应用于基因治疗研究 ［3－4］。但是较低的转染效率和瞬时蛋白表达是此类载体应用的最大障碍。因此如何提高阳离子聚合物的基因转染效率成为目前非病毒基因传递体系研究的热点问题之一 ［5］。治疗基因作用的发挥需要克服基因传递过程的各种障碍，才能获得较高的转染效率 ［6］。因此理解阳离子聚合物传递DNA的途径以及聚合复合物传递DNA过程中的主要障碍，有助于合理设计高分子基因传递载体，使其化学结构和性质符合基因传递过程中的不同要求 ［7］。

1　阳离子聚合物介导的基因传递的胞外屏障

聚合复合物在达到靶器官或靶细胞之前必须经历和克服能够使复合物转染效率降低、复合物解离、引起DNA降解或复合物被清除的各种胞外屏障，包括血液循环过程中的屏障、组织中的屏障和其他屏障 ［8－9］。

1.1　血液循环中的屏障　在基因治疗静脉给药时，聚合复合物首先必须经过血液循环才能达到靶器官或靶细胞。血液中的成分主要引起聚合复合物的聚集和导致DNA提前从复合物中释放出来，此外血浆中的核酸酶也能引起DNA的降解。这2个方面的作用均能使聚合复合物阻留或者使其转染能力下降 ［6］。

聚合复合物的稳定性取决于阳离子聚合物的结构和其与DNA的正负电荷的比。已知血浆中的红细胞、白蛋白和纤维蛋白原等易与聚合复合物发生非特异性结合，使复合物的表面电位降低，减少粒子之间的静电排斥力，最终导致复合物的聚集。过多的聚集还会引起复合物在血管壁上的沉积，血管组织内包含的高浓度富含阴离子的黏多糖也能结合富含阳离子的聚合复合物。有研究 ［10］发现：小鼠颈动脉壁可结合相对分子质量为84　000的聚赖氨酸（PLL）和聚酰胺胺树状物浓度达10g·L －1，且经过4h的动脉灌注也不会被洗脱。聚合复合物的聚集使聚合物不容易分散，降低了聚合物的转染能力，另一方面这些聚合复合物聚集的结果是容易被巨噬细胞和网状内皮细胞系统（reticuloendothelial system，RES）迅速清除，因而大大减少了聚合复合物进入靶器官和接触靶细胞的量。

1.2　组织中的屏障　聚合复合物经静脉应用后，在血流中可产生成簇的多聚物，并随血液循环到达全身各主要器官，大部分快速由肺内皮细胞、肝窦中Kupper细胞及脾中的巨噬细胞清除。此外，机体的自然防御机制如补体系统、网状内皮系统和免疫系统都可清除外来粒子 ［11］。当聚合复合物达到靶器官或靶细胞的周围组织时，将同细胞外的一些物质发生相互作用，增加的离子强度会削弱载体与DNA之间的相互作用。这些物质包括细胞外基质（如糖蛋白、硫酸软骨素和胶原等）和黏膜分泌物（如透明质酸和黏蛋白等），具体随给药方式不同而异。在细胞外环境中，聚合复合物应该足够稳定，才能高效运送到靶细胞表面。这就要求阳离子聚合物载体具有较低毒性，避免复合物和细胞外基质中蛋白的相互作用，避免DNA被降解，减少复合物和非靶向器官、组织和细胞的相互作用。细胞外基质指细胞间具有保护靶细胞作用的多聚化蛋白和糖类，在这些物质的存在区域，相对较大的DNA传递体系难以逾越 ［12－13］。

1.3　其他屏障　聚合复合物还会面临一些屏障，包括调理素（opsinnins，如血清抗体、补体等）、吞噬系统和降解酶等。这些屏障在血液循环和组织中都可能存在。其中调理素能与载体及其靶基因结合从而使基因和载体失活，聚合复合物表面多余的阳性电荷在体内能激活补体系统，造成目的基因在未到达效应细胞前被吞噬破坏；吞噬系统则是机体对于异物的非特异性防御系统，存在于机体各部位的单核吞噬细胞（也有中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的参与）对入侵的大分子物质有吞噬、消化和消除的作用，而肝和脾中的网状内皮系统则既能捕获、内吞又能消化基因传递载体系统；在血液和组织中存在的各种降解酶如血清中和胞周液中的核酸酶能迅速消化未被保护的DNA分子，从而降低达到靶细胞表面的DNA的量。

2　阳离子聚合物介导的基因传递的细胞内途径和胞内屏障

聚合复合物经历了从注射部位到达靶细胞过程中的一系列障碍，开始转染靶细胞。阳离子聚合物将质粒DNA从细胞表面传递至细胞核内部所遇到的屏障包括细胞膜、内涵体－溶酶体、细胞质、核膜和聚合复合物的解聚。

2.1　细胞内吞（endocytosis）　阳离子聚合复合物必须通过细胞内吞才能进入细胞。聚合复合物的细胞内吞机制有2种 ［8，14］：①非特异性吸附内吞（adsorptive endocytosis）。复合物表面带正电荷，通过与细胞膜表面带负电荷的硫酸蛋白多糖发生静电相互作用而被细胞吸附，从而发生细胞内吞。细胞摄取复合物的主要机制为胞吞机制的激活，当将转导细胞与细胞内吞抑制剂（如松胞菌素B及去氧葡糖）或细胞代谢抑制剂（如叠氮化钠）共孵育后，其复合物摄取率及相应转导基因的表达率均显著降低 ［15］。②特异性受体介导摄取。细胞膜表面含有很多特定的受体分子，可在阳离子聚合物表面连接上特异性的配体，通过配体与细胞上的受体结合，提高聚合复合物的靶向性，即所谓的受体介导内吞 ［16］。偶联阳离子聚合物的配体有许多，如半乳糖、甘露糖、叶酸、上皮细胞生长因子、转铁蛋白和CD3等。

2.2　内涵体的释放　聚合复合物经细胞内吞后进入内涵体（endosome），正常情况下大分子或异物被细胞内吞后，与胞膜形成内涵体，内涵体被溶酶体迅速吞噬后二者融合形成内涵体－溶酶体复合物。在内涵体－溶酶体内DNA如果不能被保护，并及时有效地被释放，则会被溶酶体内的酶降解，因此聚合复合物能否从内涵体－溶酶体中逃逸，是决定转染成功与否的关键之一。

对于结构中含有氨基的阳离子聚合物，聚乙烯亚胺（PEI）和聚酰胺胺树形分子 ［17］，在其介导的基因传递过程中，聚合复合物采用一种被称为质子海绵阳吸附作用的方式从内涵体－溶酶体中逃逸。这类分子结构中含有氨基的阳离子聚合物可以在溶酶体内的酸性条件下离子化，在pH　5～7时具有极强的缓冲能力，能够吸附大量的质子H ＋，成为“质子海绵”。这类高缓冲能力的阳离子载体随着内涵体的酸化而使内部氨基质子化，可作为弱碱基对抗内涵体的酸化作用，因此能够抑制晚期内涵体的酸化，从而随着H ＋和C1 －的内流，内涵体发生渗透性膨胀、最终破裂，释放聚合复合物 ［11］。

2.3　细胞质中的传递　聚合复合物从内涵体逸出后，能否在胞质内不被降解，从细胞质移动到核周围空间也同样影响着基因的表达和功能。细胞质由微丝和微管的复杂网、高浓度蛋白质和各种亚细胞器组成，是具有高黏度的及尺寸在300～400的筛状网状结构，只有小于250个碱基对的DNA分子在细胞质中是自由扩散的，大于54nm的分子的被动扩散会受到细胞质的限制 ［18］。细胞质的各种蛋白、微管和其他细胞器都会阻碍聚合复合物的运动。有丝分裂期间，聚合复合物可以通过胞质的分离而重新在细胞内分配，从而使一些复合物能到达细胞核附近。有证据 ［19］表明：带有正电荷的纳米聚合复合物能够通过非特异性地与负电性的微管或肌动蛋白作用而沿着细胞骨架网移动到核膜。阳离子聚合物作为DNA从胞质移动到核膜周围的传递介质，可保护DNA免于细胞质内核酸酶的降解，延长DNA在胞质内的存活时间，从而增加DNA入核的机会。

2.4　转导入核　经过细胞质的传递，DNA必须跨越核膜进入细胞核才能发挥其作用。核膜由带有核孔的双层膜组成，核孔复合物（nuclear pore complex，NPC）由大约100个不同的蛋白亚单元构成，只允许离子和小分子的自由扩散，直径小于9nm的分子或相对分子质量小于60　000的蛋白质可被动弥散通过NPC中间水通道。DNA转导入核的可能途径包括：①细胞分裂时核膜的破裂，在核膜破裂时，DNA被重新分配并定位在核内。聚合复合物或DNA因此进入细胞核。有研究 ［20］发现：在细胞进行有丝分裂时加入聚合复合物后，转染效能比细胞周期停止时要高，说明有丝分裂有利于转染的进行。Brunner等 ［21］的研究发现：在细胞分裂前不久进行的转染效率比细胞生长初期的转染效率高30～500倍，认为细胞周期分布是影响阳离子聚合物载体介导的基因转染的重要因素，有丝分裂（包括S期和G 2期）时的细胞核膜破裂可以提高转染效率。这也是增殖快的细胞转染效能比不分裂或者分裂慢的细胞高的原因。②经核孔进入。有研究 ［22］指出：当核孔直径为80nm时，虽然仅留下9nm的中央水通道，但直径小于28nm的颗粒仍然可以从核孔中通过，因此粒径小于28nm的聚合复合物有可能通过核孔进入细胞核。③与核膜融合。一些研究者 ［21］认为：聚合复合物进入到胞核会使复合物与核膜融合，由带正电荷的复合物与带负电荷的膜磷脂相互作用所介导。这个过程可能与复合物包裹有一层亲脂层有关，亲脂层可能来自聚合复合物表面附着的阴离子磷脂分子，或者是内涵体裂解后的残留片断，聚合复合物可能是因为亲脂层与核膜融合而使复合物进入核内。

2.5　阳离子聚合物／DNA复合物的解聚　在DNA转录目的基因翻译之前，阳离子聚合物／DNA复合物必须发生解聚，才能释放DNA，DNA的释放是实现转录的首要条件。DNA从聚合复合物中的解聚可能与DNA聚合酶从组蛋白上解离DNA的方式类似，也可能是细胞内的多聚阴离子如DNA和RNA取代了复合物中的质粒从而使DNA从复合物中解离 ［11］。在基因传递过程中，聚合复合物过早的解聚会导致DNA的提前降解影响目的基因的传递，而较迟的或者是不完全的分解会影响基因的有效表达 ［23］。若载体／DNA复合物的稳定性不同，则DNA的释放有可能发生在不同阶段。聚合复合物的解聚究竟发生于入核之前，还是入核之后尚有争议。多数研究者 ［24］认为：DNA在入核前从聚合复合物卸载并非必需。有研究 ［25］表明：PEI／DNA复合物基因传递过程中，DNA从内涵体中释放后，仍然是与PEI紧密结合的，DNA进入细胞核时，部分复合物并未发生解离。DNA一旦进入细胞核，转染效率主要取决于基因表达系统，经转录和翻译，最终产生目的基因编码的蛋白质。

3　阳离子聚合物的设计与展望

利用阳离子聚合物基因传递过程中的特点，研究者们设计了不同结构的新型聚合物，用以避免上述胞内外屏障对其转染效果的影响。针对不同靶器官，在阳离子聚合物的结构上嫁接特异性受体，增加聚合物靶向定位的能力 ［26－27］。如以半乳糖基团对聚合物进行化学修饰，用以增加聚合物对肝细胞的特异性吸附，增加聚合复合物转染肝细胞的效率 ［28－29］。针对聚合复合物从内涵体－溶酶体中顺利逃逸对转染过程的重要性这一特点，有研究者在转染过程中加入抑制溶酶体的药物（如氯喹），可以提高DNA的转染效率 ［30］。这是因为氯喹是弱碱，经细胞摄取后能升高内涵体的pH值，从而抑制内涵体－溶酶体之间的融合，有助于复合物从核内体中脱离出来，避免了DNA被核酸酶降解，因而能有效提高转染的效率 ［30］。为了使聚合物跨越核膜这一屏障，研究者在聚合物的结构中设计了核定位信号（nuclear localization signal，NLS）肽，有利于聚合物跨越核膜。研究 ［22］发现：将单一的NLS肽段与一个报告基因共价结合，可以使基因的表达提高1　000倍。NLS不仅可缩短DNA在胞质中的逗留时间，还可以辅助DNA进入细胞核 ［31］。目前研究最多的NLS是来自SV40的T抗原，其经典氨基酸序列为Pro－Lys－Lys－Lys－Arg－Lys－Val （PKKKRKV），这一序列得到了广泛应用。Zanta等 ［32］将环形CMV－Luc质粒线性化，然后在两端加帽，其中一端含有合成的SV40NLS，用这一质粒与PEI混合后转染细胞，转染效率显著提高。

由此可见，充分了解阳离子聚合物基因传递的过程以及屏障，对于新型阳离子聚合物的设计具有重要意义。利用阳离子聚合物的结构易于进行化学修饰的优点，可以在其表面修饰以靶向特异性配体或抗体；或在基因传递过程中，使用可以促进聚合复合物跨越胞内外屏障的药物，均有望应用于聚合物的设计之中 ［33－34］。