Caspases与蛋白激酶在凋亡中的相互作用＊

武 菲 程葆华 综述 陈 京 白 波 审校

（济宁医学院神经生物学研究所，山东 济宁，272067）

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种，其过程涉及Caspases对胞内多种蛋白的裂解作用［1］。细胞内数以百万计的可逆性磷酸化是维持细胞稳态所必需的，使得细胞能迅速适应内外环境变化，其中Caspases与蛋白激酶的双向通信是细胞内重要的磷酸化反应。蛋白激酶信号通路与Caspases通路有交互联系［2］，一方面蛋白激酶可以激活或抑制Caspases，另一方面活化的Caspases可裂解蛋白激酶，改变下游信号。另外，多种Caspases底物蛋白被蛋白激酶磷酸化后对Caspases裂解作用的敏感性改变。本文将综述蛋白激酶对Caspases及其底物的磷酸化作用，Caspases对蛋白激酶的裂解作用，以及Caspases和蛋白激酶两大类信号分子如何相互协调、调制细胞存活与凋亡。

1 蛋白激酶对Caspases的磷酸化作用

Caspases是细胞凋亡通路的重要组成部分，最初以惰性的酶原形式存在，在受到外源刺激如死亡受体配体或者内源性刺激如胞内成分损伤后，启动型Caspases首先被激活（Caspase－2、－8、－9、－10），进而水解并激活执行型（或称效应器）Caspases（Caspase－3、－6、－7），诱发大量底物的裂解［3］，引起细胞形态、代谢的改变，最终诱发凋亡，清除细胞。Caspases的活化受到多个水平的调节，如衔接蛋白介导的活化作用、翻译后修饰（包括磷酸化、亚硝基化、泛素化等）［4］。多种磷酸化现象起着调制Caspases信号通路的直接作用，其中包括蛋白激酶介导的磷酸化。

1．1 Caspase－9磷酸化

Cardone等首次报道Akt（protein kinase B，PKB／Akt）对 Caspase－9 的 磷 酸 化 作 用［5］。Akt（protein kinase B，PKB／Akt）磷酸化并抑制 Capase－9的活性，磷酸化位点为丝氨酸196（S196）［5］。但S196在物种间不够保守，未能发现小鼠 Akt磷酸化Caspase－9［6］。后来报道Caspase－9更可靠的磷酸化位点为苏氨酸125（T125），细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal－regulated kinase，ERK）及细胞周期素依赖性激酶1（cyclin－dependent kinase 1，Cdk1）均可磷酸化T125并抑制Caspase－9激活［7］。双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A（dual－specificity tyrosine－（Y）－phosphorylation－regulated kinase A1，DYRK1A）与p38丝裂原活化 蛋 白激 酶 （p38mitogen－activated protein kinase，p38MAPK）同样磷酸化 T125［8］。在神经发育过程中DYRK1A可保护视网膜细胞，抑制凋亡［8］。Caspase－9的其他磷酸化位点有酪氨酸153（Y153）、丝氨酸144（S144）、丝氨酸348（S348）。PKCζ磷酸化 Y153可增强 Caspase－9活性［4］。

1．2 Caspase－2磷酸化

在进化中高度保守的Caspase－2，是酪蛋白激酶2（casein kinase，CK2）、钙调素依赖性蛋白激酶II（calmodulin－dependent protein kinase type II，CaMKII）以及 DNA 依赖性蛋白激酶（DNA－dependent protein kinase，DNA－PK）的底物。CK2作为一个组成型激活的激酶，可以磷酸化Caspase－2的S157位点，这一位点位于Caspase招募结构域与大亚基的连接区域，从而阻止Caspase－2的二聚化以及二聚化后的活化［9］。若S157磷酸化作用缺失，Caspase－2可通过非依赖p53可诱导的死亡区 域 蛋 白 （p53－induced protein with a death domain，PIDD）结构域的方式实现自体活化，这提示CK2可持续抑制Caspase－2活化［9］。Nutt等以非洲爪蟾卵细胞提取物为实验对象，发现CaMKII磷酸化 Caspase－2的 S135，从而抑制其激活［10］。随着卵细胞提取物逐渐耗尽储备的营养物质，S135的磷酸化也逐渐减弱，最终Caspase－2激活并进入凋亡程序，细胞色素C由线粒体释放，Caspase－3激活。这些细胞凋亡的生物化学反应可由磷酸戊糖途径或者添加磷酸戊糖途径产物之一NADPH来阻止，这表明CaMKII介导的S135磷酸化与新陈代谢相关［10］。Caspase－2S135的同源区域以及它的侧链残基在哺乳动物中保守，因此，Caspase－2的磷酸化作用可能是一种生物进化中保留的方式，联系细胞代谢状态与细胞凋亡途径。但也有研究表明，在亚致死性DNA损伤的情况下，Caspase－2的S122位点（据Caspase－2的最新氨基酸序列应为S139）可被DNA－PK磷酸化而激活，诱发细胞周期停滞，而非导致细胞凋亡［11］。

1．3 Caspase－8磷酸化

已证实，Caspase－8通过酪氨酸磷酸化来进行活性调控，而非丝／苏氨酸磷酸化。Src家族的酪氨酸激酶Src、Fyn、Lyn磷酸化Caspase－8的Y380位点并抑制其活性。Y380磷酸化可抑制Fas诱导的Caspase－8激活，并调节抗凋亡信号。Lyn除了磷酸化Caspase－8的Y380，还可磷酸化Y465，同样抑制其活性［12］。Caspase－8除了参与细胞凋亡，也参与调控细胞迁移与黏附，Caspase－8若表达缺失将导致细胞移动性减弱［13］。Caspase－8Y380磷酸化不仅可以抑制凋亡，促进细胞迁移，还可调节胚胎发育以及肿瘤发展。

1．4 Caspase－3磷酸化

蛋白激酶既可以作用于启动型Caspases调控凋亡启动，还可以通过直接作用于执行型Caspases调制凋亡信号。如Caspase－3的磷酸化位点为S150，表达于其大亚基，并且在其他启动型与执行型 Caspases中 高度保守（Caspase－1、－2、－4、－5、－7、－8、－9）。P38MAPK 可磷酸化 Caspase－3S150并抑制其活性，还可磷酸化Caspase－8S364。而蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）结合Caspase－3可以抵消p38MAPK的磷酸化作用，使S150去磷酸化［14］。PKCδ也可以磷酸化Caspase－3，增强其活性，但磷酸化位点尚不明确［15］。值得注意的是，PP2AAα亚基以及PKCδ同时又是Caspase－3的底物，Caspase－3可以水解这些酶，从而增强两者活性，形成正反馈放大Caspase－3的作用，放大凋亡信号。

1．5 其他凋亡调节子磷酸化

蛋白激酶还可以通过作用于Caspase结合蛋白等其他凋亡调节子，间接调节Caspases活性。如p53肿瘤抑制因子可通过多个通路被多种蛋白激酶磷酸化从而改变功能性质。促凋亡蛋白Bad同样也可被多种蛋白激酶磷酸化［16］，依据蛋白激酶及磷酸化位点的不同，磷酸化可促进或者抑制其促凋亡效应。

2 Caspases对蛋白激酶的作用

有些蛋白激酶本身即Caspases的底物，Caspases被激活后可进一步作用于蛋白激酶，引起下游信号的改变，从而发挥生物学效应。多种蛋白激酶如PKCδ，可被Caspases裂解激活，从而加快凋亡进程。蛋白激酶的激活机制包括催化结构域与抑制结构域因裂解而分离，裂解产物的重分布，及裂解后底物亲和性改变。但是首要的，Caspases裂解蛋白激酶的产物必须能正确折叠为活化形式，具有稳定的催化功能，并且耐受进一步的降解。Dix等［17］报道，约35%的裂解产物具有显著的稳定性。如细胞周期素25A（cell division cycle 25A，CDC 25A）被Caspase裂解后的产物比其原长片段蛋白更稳定，并且蛋白激酶的Caspase裂解位点位于两结构域的链接区。因此，仍可得到近乎完整的结构域片段［17］，这可能是裂解产物在功能上高度稳定的原因之一。

以PKC为例，Caspase－3可裂解PKC的δ、ε、ζ、θ、η、μ几个亚型，分离酶结构域与自抑结构域，从而产生组成型激活酶蛋白片段。如PKCδ具有N端膜靶向结构域、C端核定位信号（nuclear localization signal，NLS），经Caspase裂解后的片段可以定位于细胞核，并磷酸化多种蛋白如核纤层蛋白B（lamin B）、DNA－PK、p53、p73β、细胞周期调控蛋白9（cell cycle checkpoint control protein 9，Rad9）［18］，PKCδ的核 内积聚对诱发凋亡至关 重要。Caspase裂解PKCδ的产物同样可以移位于线粒体，磷酸化抗凋亡Bcl－2家族成员髓样细胞白血病－1蛋白（myeloid cell leukemia－1，Mcl－1）［19］。

PKCδ等蛋白激酶经Caspases水解后可以增强其促凋亡活性，帮助执行程序性细胞死亡。Caspase介导的水解同样可能使激酶失活，从而终止存活信号，如黏附激酶（focal adhesion kinase，FAK）以及Akt。Bachelder等发现，过表达的野生型Akt可以由Caspases裂解失活，而Akt突变型蛋白不能被Caspases裂解，因而明显减弱或延迟细胞凋亡［20］。核转录因子 NF－κB信号通路中的多种成分均为Caspases的靶点，Caspases可使NF－κB信号通路失活，阻断存活信号［21］。另外，Caspase裂解激活 NF－κB抑制因子（inhibitor of NF－κB，IκBα），进一步阻断存活信号［21］。上述研究结果提示Caspase介导的促存活蛋白激酶失活对凋亡起着重要作用。

3 蛋白激酶对Caspase底物的磷酸化作用

蛋白激酶与Caspases的相互作用远远超出其各自单独作用，蛋白激酶除了磷酸化Caspases，还可直接磷酸化Caspases的底物，明显改变底物对Caspases裂解的敏感性。如Akt可磷酸化MST1（mammalian sterile20－like kinase 1）的 T387 位点，从而抑制MST1被Caspases水解［22］。蛋白激酶CK1、CK2磷酸化Bid的 T58、S61、S64 3个位点，与Caspases的裂解位点相邻，保护Bid免于Caspase－8裂解［23］。肿瘤抑制因子 PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）可由CK2磷酸化而免受Caspase－3裂解。磷脂酶 C－γ1（phospholipase C－γ1，PLCγ1）为Caspase－3与Caspase－7的底物，其磷酸化位点酪氨酸771（Y771）与Caspases裂解位点相邻，PLCγ1磷酸化后对Caspases裂解作用的敏感性将减弱。另 有 Presenilin－2、Max、Connexin 45．6、Nogo－B等Caspases的底物，在Caspases裂解位点的临近残基被磷酸化后可阻断Caspases裂解，从而参与调制细胞存活或凋亡。

磷酸化除了可以抑制Caspase介导的底物水解，同样可以增强Caspases的作用，最终抑制或者促进凋亡，取决于底物的性质。如激酶Src磷酸化Caspase－3酪氨酸332（Y332）位点后可以增强Caspase－3对PKCδ的裂解［24］。C－Jun氨基末端激酶（c－Jun N－terminal kinase，JNK）磷酸化 Bcl－2家族蛋白BimEL后，BimEL对Caspase－3裂解的敏感性增强［25］。

4 应用

在蛋白激酶与Caspases交互作用的情况下，分别检测蛋白激酶家族的共有识别序列以及Caspases家族的共有识别序列，结果提示两者共有识别序列可能存在重叠，并且多种蛋白磷酸化的位点临近Caspases的裂解位点。因为天冬氨酸为Caspases的裂解位点，这一点提示蛋白激酶与Caspases的识别序列如确有重叠，其主要特异性识别序列可能为酸性氨基酸残基，可能包括嗜酸性蛋白激酶（如蛋白激酶CK1、CK2）的识别序列。

CK2是蛋白激酶网络中的一个组成部分，已发现CK2可以通过磷酸化机制保护多种胞内蛋白质。CK2 可磷酸化 Bid、Max、PTEN、Caspase－9等，使其免于其他Caspases的裂解。既然CK2可保护某些蛋白免于Caspases裂解，那么增高的CK2可能会促进细胞存活；CK2水平降低将致细胞对凋亡刺激更敏感。Guo等报道CK2表达升高明显增强凋亡刺激后前列腺癌细胞的存活［26］。另有大量报道肿瘤细胞的存活必需CK2。而用抑制剂抑制CK2活性或用siRNA／RNAi抑制其表达，都会使细胞对多种凋亡刺激更敏感。

多种肿瘤包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌、白血病等，CK2活性异常增高。采用基因表达连续分析（serial analysis of gene expression，SAGE）的方法检测在转移性肿瘤组织中表达上调的基因，结果显示多种组织来源的肿瘤均有CK2表达异常增高。虽然目前CK2的胞内调节机制尚未完全阐明，但有相当多的证据表明，CK2为组成型激活。某些蛋白激酶需要磷酸化等刺激才可活化，而CK2表达时其催化亚基即具有催化活性，不需要额外的刺激。因此，可以推测在白血病细胞等肿瘤细胞中CK2的异常增高，会导致生理性CK2底物超磷酸化。另外，异常过表达的CK2若同时伴随其亚细胞分布的变化，出现在生理情况下本不表达的区域，CK2将磷酸化非典型底物，即正常CK2水平不会磷酸化的蛋白将被磷酸化。因此，不论CK2水平的异常增高磷酸化的是生理性底物或病理性底物，都可能导致对凋亡刺激的反应降低及细胞存活增强。上述研究结果指示CK2有潜力成为分子治疗靶点。

5 小结与展望

已证实多种疾病都与蛋白激酶及其调制的信号转导有关，蛋白激酶已经成为一大类潜在的治疗靶点。例如，蛋白激酶抑制剂伊马替尼可特异的抑制BCR－ABL蛋白激酶，目前已成功地应用于慢性髓细胞性白血病的治疗。虽然有多种蛋白激酶抑制剂具有应用于分子靶向治疗的潜力，但是困难同样存在。首先，需要克服蛋白激酶抑制剂的靶点外效应。靶点外效应可能是因为靶向蛋白激酶与其超家族其他成员甚至其他类激酶具有结构或者功能上的共同点，因此造成某一激酶抑制剂的作用牵涉到其他酶类。例如，有一类蛋白激酶抑制剂是靶向于激酶的催化位点，竞争性抑制与ATP的结合，因此，靶点外效应可能源自抑制剂对其他ATP结合蛋白的交叉作用。其次，磷酸化作为一种基础调节机制无处不在，许多蛋白激酶具有多效性，并参与多种生理病理反应，包括正常细胞生理稳态的维持。因此，尽管已经发现多种蛋白激酶在某些疾病状态下功能紊乱，具有成为治疗靶点的潜力，仍需要首先明确抑制这些酶类对正常细胞功能有怎样的影响。

除蛋白激酶外，细胞内另有Caspases网络参与凋亡的起始与执行，调节细胞存活，Caspases网络的紊乱可诱发细胞存活状况的改变。但是以Caspases为治疗靶点也有困难，因为Caspases家族成员也有结构和功能上的共性，因此难以选择性的靶向某一特异的Caspase成员。除了参与凋亡，Caspases同样参与分化等非细胞死亡或凋亡的过程，提示我们需要区分Caspases在生理稳态以及疾病状态时的作用。

Caspases与蛋白激酶存在交互作用，磷酸化可以保护Caspases及其底物免于裂解，致使细胞对凋亡刺激反应减弱、细胞存活增强。一方面，CK2等蛋白激酶表达增高或活性增强，使Caspases及其底物裂解减少，细胞对凋亡刺激敏感性下降，这可能是肿瘤发生的机制之一；另一方面，脑缺血等病理情况可能诱发CK2等蛋白激酶活性减弱、表达下调，使细胞对凋亡刺激反应增强。因此，明确蛋白激酶网络与Caspases网络的交互作用，两者在生理与病理情况下的调节机制具有至关重要的意义。

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